Phytomedicine (1區(qū)-TOP) I 紅花逍遙片破解PMS多維病機：從入血成分到腸道菌群，揭示中藥復方“雙通路”調(diào)控 (李后開-上海中醫(yī)藥大學)

2026年4月5日，上海交通大學醫(yī)學院附屬上海兒童醫(yī)院、上海中醫(yī)藥大學藥學院李后開團隊聯(lián)合中國中醫(yī)科學院中藥研究所張彥瓊團隊、上海中醫(yī)藥大學藥學院鄭寧寧團隊、澳門大學中藥質(zhì)量研究國家重點實驗室萬建波團隊等在Phytomedicine（中科院1區(qū)-TOP期刊，IF=8.3）在線發(fā)表題為 “Mechanistic study on the holistic actions of Hong-Hua-Xiao-Yao Tablet in alleviating premenstrual syndrome in rats” 的研究論文。

該研究圍繞上市中成藥紅花逍遙片（Hong-Hua-Xiao-Yao Tablet, HHXYT） 改善經(jīng)前綜合征（PMS）的作用機制展開，綜合運用血清代謝組學、組織特異性轉(zhuǎn)錄組學、16S rRNA測序、含藥血清藥效驗證、入血成分分析、離體腸菌共培養(yǎng)及偽無菌動物模型，系統(tǒng)闡明紅花逍遙片通過“入血成分直接發(fā)揮藥效”與“腸道菌群介導間接轉(zhuǎn)化”雙重機制改善PMS的整體作用模式。

經(jīng)前綜合征是一類與月經(jīng)周期密切相關(guān)的神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂性疾病，患者常表現(xiàn)為焦慮、抑郁、易怒、情緒波動等精神癥狀，同時伴隨乳房脹痛、頭痛、腹脹、肌肉疼痛等軀體不適。由于PMS病因復雜，涉及神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫炎癥、代謝及腸道菌群等多個層面，傳統(tǒng)單一靶點干預往往難以全面解釋其發(fā)病機制，也難以充分體現(xiàn)中藥復方的整體調(diào)節(jié)優(yōu)勢。紅花逍遙片源于經(jīng)典方逍遙散，由竹葉柴胡、當歸、白芍、白術(shù)、茯苓、薄荷、紅花、皂角刺、甘草等九味藥組成，臨床上已用于PMS治療，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和系統(tǒng)作用機制長期不夠清晰。

本研究首先從整體層面對紅花逍遙片的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行解析。研究團隊通過血清代謝組學結(jié)合卵巢、子宮和海馬組織轉(zhuǎn)錄組學發(fā)現(xiàn)，紅花逍遙片能夠顯著調(diào)節(jié)PMS大鼠體內(nèi)異常的代謝譜和靶器官基因表達譜，主要涉及葡萄糖-6-磷酸代謝、鞘脂代謝、甘油磷脂代謝等關(guān)鍵通路。這說明紅花逍遙片并非只針對某一個癥狀或單一器官發(fā)揮作用，而是通過代謝—轉(zhuǎn)錄—靶器官聯(lián)動的方式，協(xié)同改善PMS相關(guān)的神經(jīng)內(nèi)分泌失衡、炎癥反應和機體代謝紊亂。

在“直接藥效”層面，研究進一步發(fā)現(xiàn)，紅花逍遙片含藥血清可特異性抑制小膠質(zhì)細胞的神經(jīng)炎癥反應，而對其他PMS相關(guān)細胞的抑炎作用相對有限。成分分析顯示，紅花逍遙片入血成分中以甘草來源化合物占比較高，其中 甘草酸、18β-甘草次酸、甘草苷和甘草素 等成分能夠顯著抑制小膠質(zhì)細胞炎癥反應。由于焦慮、抑郁、情緒波動等PMS核心癥狀與神經(jīng)炎癥密切相關(guān)，這一結(jié)果提示：紅花逍遙片中的部分入血活性成分可能通過直接進入循環(huán)并作用于中樞炎癥相關(guān)細胞，從而緩解PMS的情緒和神經(jīng)行為異常。

更值得關(guān)注的是，研究發(fā)現(xiàn)方中君藥竹葉柴胡相關(guān)入血原型成分并不明顯，這提示其療效可能并不主要依賴“直接入血”，而是通過腸道菌群代謝轉(zhuǎn)化等間接機制發(fā)揮作用。為驗證這一假設(shè)，研究團隊進一步開展16S rRNA測序、偽無菌動物模型和離體腸菌共培養(yǎng)實驗。結(jié)果顯示，紅花逍遙片能夠改善PMS大鼠腸道菌群紊亂，使菌群結(jié)構(gòu)向正常狀態(tài)回歸；當腸道菌群被抗生素削弱后，紅花逍遙片改善雌激素水平、海馬神經(jīng)元損傷和行為學異常的效果也隨之減弱，說明腸道菌群至少部分參與了紅花逍遙片的治療作用。

在機制深化方面，研究進一步證明，經(jīng)過腸道菌群代謝后的紅花逍遙片可在細胞層面緩解炎癥、氧化應激和激素失衡。具體而言，菌群代謝后的紅花逍遙片能夠降低炎癥因子表達，改善KGN細胞中的氧化應激狀態(tài)，并對FSH、LH等激素相關(guān)指標產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。這一發(fā)現(xiàn)將紅花逍遙片的作用機制從“藥物—宿主”拓展為“藥物—菌群—宿主”三方互作模式，也更符合中藥復方多成分、多靶點、多環(huán)節(jié)協(xié)同干預疾病的特點。

該研究的亮點在于，它沒有簡單停留在“某幾個成分對應某幾個靶點”的線性解釋，而是從整體藥效出發(fā)，將入血成分、神經(jīng)炎癥、代謝重編程、靶器官轉(zhuǎn)錄調(diào)控和腸道菌群轉(zhuǎn)化整合到同一研究框架中。研究明確提出紅花逍遙片改善PMS存在兩條互補路徑：一方面，部分入血活性成分可直接抑制小膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥；另一方面，未被直接吸收的成分可通過調(diào)控和依賴腸道菌群，進一步影響炎癥、氧化應激和激素穩(wěn)態(tài)。

總體來看，這項研究為紅花逍遙片治療PMS提供了系統(tǒng)性的現(xiàn)代藥理學證據(jù)，也為中藥復方機制研究提供了一個較好的范式：既要關(guān)注“入血成分”的直接藥效，也不能忽視“未入血成分”經(jīng)腸道菌群轉(zhuǎn)化后的間接貢獻。未來，圍繞紅花逍遙片關(guān)鍵活性成分、菌群代謝產(chǎn)物以及“腸—腦—卵巢/子宮軸”的深入研究，有望進一步推動PMS治療從經(jīng)驗用藥走向機制明確、靶點清晰、物質(zhì)基礎(chǔ)可追溯的精準干預。

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【摘要】

背景：經(jīng)前綜合征（PMS）是一種周期性神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂，可對全球女性的身心健康造成不良影響。紅花逍遙片（HHXYT）是一種已上市的中成藥，臨床上對PMS具有明確治療作用。然而，由于PMS本身及HHXYT組成均極為復雜，其潛在機制仍缺乏清晰認識。

目的：闡明HHXYT改善PMS的系統(tǒng)性作用機制。

方法：本研究采用血清代謝組學與組織特異性轉(zhuǎn)錄組學相結(jié)合的整合策略，識別HHXYT影響的關(guān)鍵代謝通路；同時利用16S rRNA基因測序評估腸道菌群組成。研究還通過體外實驗評價其在PMS相關(guān)細胞中的抗神經(jīng)炎癥作用，并進一步驗證入血成分的生物活性。腸道菌群的作用則通過離體培養(yǎng)和偽無菌模型進一步探究。

結(jié)果：HHXYT影響血清代謝物譜及靶器官轉(zhuǎn)錄譜，主要涉及葡萄糖-6-磷酸代謝、鞘脂代謝和甘油磷脂代謝，從而改善PMS的全身性癥狀。此外，HHXYT含藥血清可特異性抑制小膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥，而不影響其他PMS相關(guān)靶細胞。隨后，研究鑒定出62種入血成分，主要來源于甘草（GC，36種化合物）。其中，4種來源于甘草的化合物——甘草酸、18β-甘草次酸、甘草苷和甘草素——顯著抑制小膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥。值得注意的是，君藥竹葉柴胡來源的入血成分未被檢測到，提示其治療作用可能通過涉及腸道菌群代謝的間接機制實現(xiàn)。通過離體培養(yǎng)和偽無菌模型，研究進一步發(fā)現(xiàn)腸道菌群部分介導了HHXYT的治療效益，且HHXYT有助于維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)。此外，研究還觀察到經(jīng)腸道菌群代謝后的HHXYT有助于緩解炎癥、氧化應激和激素失衡。

結(jié)論：本研究從整體層面揭示了HHXYT抗PMS作用背后的雙重機制，即直接生物活性與菌群依賴效應，強調(diào)了宿主—菌群相互作用在中藥作用發(fā)揮中的重要性。

關(guān)鍵詞：紅花逍遙片；經(jīng)前綜合征；代謝組學；轉(zhuǎn)錄組學；腸道菌群；入血成分。

01

研究背景及科學問題

經(jīng)前綜合征（PMS）是一種影響育齡女性的周期性神經(jīng)內(nèi)分泌紊亂，主要表現(xiàn)為情緒波動、焦慮、易怒和抑郁等情緒癥狀，同時伴有乳房脹痛、頭痛、腹脹和肌肉疼痛等軀體表現(xiàn)。這些癥狀通常出現(xiàn)在黃體期，并在月經(jīng)來潮后緩解。PMS的發(fā)病機制目前尚未完全闡明。因此，常規(guī)治療多集中于激素調(diào)節(jié)，但其療效往往難以持續(xù)。紅花逍遙片（HHXYT）是在經(jīng)典方逍遙散基礎(chǔ)上優(yōu)化形成的制劑，由九味中藥組成，包括竹葉柴胡、當歸、白芍、白術(shù)、茯苓、薄荷、紅花、皂角刺和甘草。該藥是臨床批準用于PMS管理的中成藥。盡管臨床證據(jù)支持其有效性和安全性，但其藥理機制與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)仍不清楚。

中藥復方的作用通常由多成分之間的相互作用介導，并通過多種通路發(fā)揮效應?？诜兴幖瓤赏ㄟ^被吸收入血的成分發(fā)揮藥理作用，例如進入體循環(huán)后直接調(diào)節(jié)宿主生理功能的黃酮類和萜類化合物；也可通過難以吸收的成分發(fā)揮作用，例如皂苷和多糖等。這類成分可能通過與腸道菌群相互作用而產(chǎn)生效應。一方面，未被吸收的成分可調(diào)節(jié)腸道菌群的組成和代謝活性；另一方面，其中部分成分也可被腸道菌群代謝，生成新的生物活性分子，或促進其吸收。鑒于中藥、腸道菌群和宿主之間存在復雜互作，闡明中藥整體作用需要采用多維度策略，同時考慮吸收成分的直接作用，以及未吸收成分在腸道中的作用。

鑒于PMS機制和HHXYT成分均具有高度復雜性，本研究在前期已經(jīng)驗證HHXYT對PMS模型療效的基礎(chǔ)上，采用多組學方法系統(tǒng)解析HHXYT治療PMS的整體機制。研究首先進行非靶向代謝組學、轉(zhuǎn)錄組學和16S rRNA基因測序，系統(tǒng)評估HHXYT處理后PMS大鼠血清代謝、組織特異性轉(zhuǎn)錄改變以及腸道菌群組成變化。隨后，研究在相關(guān)靶細胞中檢測HHXYT代表性入血成分的直接作用，并通過腸道菌群與HHXYT成分的離體共培養(yǎng)探索微生物生物轉(zhuǎn)化的作用。結(jié)果表明，HHXYT通過多維方式緩解PMS癥狀，包括調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌通路、炎癥反應以及部分依賴腸道菌群的生物轉(zhuǎn)化，突出體現(xiàn)了HHXYT對PMS綜合征的整體調(diào)控作用。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點

HHXYT通過改變代謝組學和多組織轉(zhuǎn)錄組學特征改善PMS

HHXYT改善大鼠PMS的療效已經(jīng)得到驗證。為覆蓋PMS癥狀的廣泛譜系，研究對血清樣本進行代謝組學分析，并對卵巢、子宮和海馬組織進行轉(zhuǎn)錄組學分析。該策略用于刻畫PMS大鼠在有無HHXYT干預條件下的綜合變化，實驗流程見圖1A。

基于LC-MS和GC-MS的非靶向代謝組學整合分析顯示，血清樣本中存在六類主要代謝物，包括溶血磷脂酰膽堿（LPC）、磷脂酰膽堿（PC）、氨基酸、有機酸、胺類和碳水化合物。偏最小二乘判別分析（PLS-DA）顯示，各組之間的代謝譜存在可辨別差異。值得注意的是，HHXYT處理組呈現(xiàn)向?qū)φ战M代謝模式移動的趨勢，提示PMS誘導的代謝紊亂得到部分恢復。對照組與模型組之間共鑒定出114種差異代謝物，其中49種上調(diào)、65種下調(diào)；模型組與HHXYT組之間鑒定出42種差異代謝物，其中37種上調(diào)、5種下調(diào)。差異代謝物富集的主要功能通路涉及氮代謝，以及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成。對組織轉(zhuǎn)錄組譜（卵巢、子宮和海馬）的Venn分析顯示，不同組之間既存在共享表達基因，也存在特異表達基因，提示治療引發(fā)了組織特異性反應。

為系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)生物標志物，研究進一步對代謝組學和轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)進行整合差異分析?；鹕綀D顯示，模型組與對照組之間，以及HHXYT處理組與模型組之間均存在不同的代謝模式。HHXYT干預顯著逆轉(zhuǎn)了模型組中膽酰絲氨酸、lysoPA(i-20:0/0:0)和甘氨鵝脫氧膽酸水平下降的趨勢。進一步的平行轉(zhuǎn)錄組學分析表明，卵巢、子宮和海馬組織存在組織特異性的差異表達模式。與對照組相比，模型組在卵巢、子宮和海馬組織中分別檢測到1036個、404個和156個差異表達基因，其中卵巢為80個上調(diào)、956個下調(diào)，子宮為319個上調(diào)、85個下調(diào)，海馬為75個上調(diào)、81個下調(diào)。HHXYT處理則分別顯著調(diào)節(jié)這些組織中的629個、162個和249個差異表達基因，其中卵巢為497個上調(diào)、122個下調(diào)，子宮為85個上調(diào)、77個下調(diào)，海馬為209個上調(diào)、40個下調(diào)。

HHXYT逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵差異表達基因包括與卵巢功能相關(guān)的Cuzd1（細胞外基質(zhì)重塑）、Gad2（GABA能信號）和Themis3（T細胞調(diào)節(jié)），子宮中表達的Anlnl1（細胞骨架組織），以及海馬中的Selenow（抗氧化反應）。這些靶點的協(xié)同正常化提示，HHXYT可能通過多組織層面的神經(jīng)內(nèi)分泌—免疫串擾調(diào)節(jié)改善PMS癥狀。

代謝組學與多器官轉(zhuǎn)錄組學譜的整合顯示，HHXYT干預后神經(jīng)酰胺代謝過程、鞘脂代謝過程和膜脂生物合成過程發(fā)生富集。對前50個差異基因構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖后發(fā)現(xiàn)，葡萄糖-6-磷酸代謝、鞘脂代謝和甘油磷脂代謝出現(xiàn)顯著改變。這些結(jié)果提示，HHXYT影響血清代謝譜和靶器官轉(zhuǎn)錄譜，從而改善PMS的全身性癥狀。

為進一步闡明循環(huán)代謝物與組織特異性基因表達之間的分子聯(lián)系，研究構(gòu)建Sankey圖，以可視化特定代謝物、共享通路及靶組織相應基因之間的連接關(guān)系。例如，鳥氨酸和天冬酰胺分別與谷胱甘肽代謝以及丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代謝相關(guān)，并進一步影響海馬和子宮中的Gstm2以及海馬和子宮中的Il4i1。鞘氨醇和二氫神經(jīng)酰胺通過海馬和子宮中的Mapk13與鞘脂信號相連，而多種溶血磷脂（LysoPC、LysoPE）則通過Etnk2匯聚于甘油磷脂代謝。這些發(fā)現(xiàn)從系統(tǒng)層面展示了HHXYT如何通過相互連接的代謝和轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)協(xié)調(diào)多組織反應。

圖1 多組織代謝組學和轉(zhuǎn)錄組學分析揭示PMS大鼠對HHXYT治療反應中的代謝與基因表達變化。（A）大鼠組織取樣、組學測序和整合分析的實驗設(shè)計示意圖。（B）對照組、模型組和HHXYT組的PLS-DA代謝組譜（對照組n=7，模型組n=8，HHXYT組n=7）。（C）PMS相關(guān)靶器官（卵巢、子宮和海馬）中所有表達基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)Venn分析（每組n=3）。（D）血清差異表達代謝物以及卵巢、子宮和海馬差異表達基因的火山圖。紅框中的數(shù)字表示上調(diào)的差異代謝物/差異表達基因數(shù)量，藍框中的數(shù)字表示下調(diào)的差異代謝物/差異表達基因數(shù)量；各組樣本量與B和C相同。

圖2 整合代謝組學和轉(zhuǎn)錄組學分析揭示HHXYT調(diào)節(jié)PMS大鼠相關(guān)通路。（A）模型組與HHXYT組之間前50個差異表達代謝物和差異表達基因的生物過程（Gene Ontology）富集分析。（B）模型組與HHXYT組之間前50個差異表達基因的蛋白—蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)使用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建，第一層相互作用因子數(shù)量限制為50，并采用高置信度閾值（0.700）。各組樣本量與圖1相同。

HHXYT含藥血清及其活性成分改善小膠質(zhì)細胞炎癥

PMS中的失調(diào)基因主要參與神經(jīng)系統(tǒng)功能、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)、血液循環(huán)以及免疫炎癥平衡，這與抑郁、焦慮和血瘀等臨床表現(xiàn)相對應。神經(jīng)炎癥被認為是抑郁和焦慮的重要促發(fā)因素，外周炎癥也會調(diào)節(jié)疾病進展。既往體內(nèi)結(jié)果也支持這一點，即PMS大鼠模型中子宮炎癥因子升高，而HHXYT處理可有效逆轉(zhuǎn)該變化。因此，為探索HHXYT在體外的藥效作用，研究使用LPS刺激PMS相關(guān)細胞（BV-2細胞、RAW 264.7細胞、大鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞和KGN細胞），建立神經(jīng)和外周炎癥模型。由于中藥成分通常通過系統(tǒng)吸收后的成分發(fā)揮作用，研究制備HHXYT含藥血清，并評估其在LPS刺激下對上述四類細胞的抗炎作用。

在BV-2細胞中，LPS顯著增加炎癥因子表達；相比之下，20% HHXYT含藥血清相較模型組顯著降低Tnfα、Il1β和Inos水平。然而，該含藥血清對另外三類細胞未顯示顯著作用。研究進一步確認，20% HHXYT含藥血清可通過TLR4/NF-κB通路緩解LPS誘導的BV-2細胞神經(jīng)炎癥。

為識別具體的抗神經(jīng)炎癥成分，研究分析了HHXYT提取物和HHXYT含藥血清的化學譜。提取物中共鑒定出126種化合物，并進一步解析其結(jié)構(gòu)分類和植物來源。值得注意的是，檢測到72種入血成分，包括24種三萜、18種黃酮、10種有機酸、6種單萜、4種酞內(nèi)酯以及其他成分。對各味藥對這些成分的貢獻進行量化后發(fā)現(xiàn)，甘草（GC）來源成分最多，共36種化合物，其次為白芍（BS，17種）及其他藥味（如DG、ZYCH）。

隨后，研究評估了來自白芍和甘草的7種潛在活性成分在BV-2細胞中的抗神經(jīng)炎癥作用。與對照組相比，LPS刺激（模型組）顯著升高Tnfα、Il1β和Inos表達；而甘草酸、18β-甘草次酸、甘草苷和甘草素顯著降低Tnfα和Il1β mRNA水平。此外，甘草酸、甘草苷、甘草素和芒柄花素顯著抑制Inos表達。為進一步表征這些活性成分在體內(nèi)的暴露情況，研究對代表性成分開展藥代動力學研究。在7種可檢測化合物（芍藥苷、Z-藁本內(nèi)酯、芒柄花素、甘草素、甘草苷、甘草酸和18β-甘草次酸）中，建立了濃度—時間曲線及關(guān)鍵藥代動力學參數(shù)。重要的是，藥代動力學分析證實了4種甘草來源化合物（甘草酸、18β-甘草次酸、甘草苷和甘草素）能夠進入腦內(nèi)，強調(diào)其作為直接中樞神經(jīng)系統(tǒng)活性成分的潛力。

圖3 HHXYT含藥血清緩解小膠質(zhì)細胞神經(jīng)炎癥并表征其生物活性成分。（A）HHXYT含藥血清作用于細胞實驗的流程圖。（B-E）20% HHXYT含藥血清對LPS誘導的PMS相關(guān)靶細胞炎癥因子表達水平的影響（B：BV-2細胞；C：RAW 264.7細胞；D：大鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞；E：KGN細胞）。（F）HHXYT入血成分的化合物結(jié)構(gòu)分類。（G）各味藥所含化學成分數(shù)量。（H）HHXYT的7種入血原型成分對LPS誘導的BV-2細胞炎癥因子表達水平的影響。各成分測試濃度如下：芍藥苷100 μM；白芍苷100 μM；甘草酸50 μM；18β-甘草次酸10 μM；甘草苷50 μM；甘草素10 μM；芒柄花素1 μM。結(jié)果以均值±SEM表示（每組n=3），多組比較采用單因素方差分析評估統(tǒng)計學顯著性（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

HHXYT緩解PMS大鼠腸道菌群紊亂

在確認HHXYT具有直接抗神經(jīng)炎癥作用后，研究進一步關(guān)注未被吸收入血成分的潛在作用。對HHXYT成分在入血前后的分析顯示，部分中藥質(zhì)量標志物成分未被檢測到，尤其是來源于君藥竹葉柴胡的成分。這一發(fā)現(xiàn)提示，腸道菌群可能介導未吸收成分的治療作用。

因此，研究采用16S rRNA基因測序評估HHXYT對PMS大鼠腸道菌群的影響。α多樣性分析（Sobs和Shannon指數(shù)）顯示，各組之間無顯著差異。然而，PCoA分析顯示，對照組與模型組明顯分離，而HHXYT組更接近對照組，提示HHXYT可調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)。組成分析表明，HHXYT干預逆轉(zhuǎn)了模型誘導的若干菌科變化，包括Eggerthellaceae、Bifidobacteriaceae、Christensenellaceae和Eubacterium_coprostanoligenes_group。LEfSe分析顯示，在屬水平上，模型組和HHXYT組分別存在9個和6個差異豐度分支。多組比較進一步顯示，HHXYT給藥顯著調(diào)節(jié)多個菌種的豐度，包括Lactobacillus_johnsonii、Lactobacillus_murinus、Corynebacterium_stationis、Streptococcus_hyointestinalis、Corynebacterium_glutamicum、metagenome_g_Lachnospiraceae_ND3007_group和Akkermansia_muciniphila，且不同菌種呈現(xiàn)不同響應模式。

隨后，微生物代謝功能預測顯示，類固醇激素生物合成、甲狀旁腺激素合成以及甲苯降解等通路在模型組中顯著降低，而在HHXYT給藥后升高。此外，Spearman相關(guān)性分析揭示了HHXYT影響的特定腸道微生物與血清代謝物之間存在顯著關(guān)聯(lián)。值得注意的是，Akkermansia豐度與神經(jīng)肽cortistatin A和脂質(zhì)信號分子鞘氨醇呈正相關(guān)，而Corynebacterium與脂質(zhì)化合物呈負相關(guān)，并與抗炎化合物青蒿素呈正相關(guān)。總體而言，這些發(fā)現(xiàn)表明HHXYT可改善PMS大鼠腸道菌群紊亂。

有趣的是，上述多個菌群相關(guān)代謝物（例如鞘氨醇、鳥氨酸、溶血磷脂）也是整合代謝組—轉(zhuǎn)錄組網(wǎng)絡(luò)中的核心節(jié)點，提示腸道菌群可能通過相關(guān)軸線影響宿主基因表達。例如，與Akkermansia正相關(guān)的鞘氨醇與鞘脂信號通路及海馬、子宮中的Mapk13表達相連。類似地，與多個細菌屬相關(guān)的鳥氨酸連接到谷胱甘肽代謝以及靶組織中的Gstm2表達。這些發(fā)現(xiàn)表明，HHXYT可改善PMS大鼠腸道菌群紊亂，并揭示了可能參與其治療作用的菌群—代謝物—宿主基因軸。

圖4 HHXYT調(diào)節(jié)PMS大鼠腸道微生物組結(jié)構(gòu)和功能。（A）以Sobs和Shannon指數(shù)表示的α多樣性。（B）基于Bray-Curtis距離的屬水平PCoA分析。（C）科水平腸道菌群組成（群落柱狀圖分析）。（D）LEfSe分析。（E）物種水平腸道菌群差異分析（Kruskal-Wallis H檢驗柱狀圖）。（F）基于16S rRNA基因測序數(shù)據(jù)并由PICRUSt2預測的PMS大鼠HHXYT干預相關(guān)腸道微生物群功能變化熱圖。推斷微生物功能譜后，對各組KEGG第3層級通路進行比較（粉色表示上調(diào)，綠色表示下調(diào)）。（G）HHXYT干預改變的代謝物與微生物之間的Spearman相關(guān)性分析。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示（每組n=5），*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

腸道菌群部分介導HHXYT對PMS的治療效益

為確定HHXYT的治療效益是否依賴腸道菌群，研究在偽無菌大鼠模型中評估其療效。卵巢組織病理學分析和凝血參數(shù)顯示，各組之間無顯著差異。與對照組相比，模型組大鼠血清和卵巢組織中的E2水平均顯著降低。HHXYT處理可有效逆轉(zhuǎn)這些變化；然而，在腸道菌群耗竭后，其治療效果減弱。模型組血清孕酮水平顯著升高，而HHXYT處理可有效逆轉(zhuǎn)該變化；但卵巢孕酮水平在各組之間無顯著差異。

Nissl染色顯示，模型組海馬CA1和CA3區(qū)域存在神經(jīng)元損傷，表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)萎縮和變形，并伴隨CA3區(qū)域神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。HHXYT干預改善了這些形態(tài)學異常，并部分恢復CA3區(qū)神經(jīng)元密度；而在菌群耗竭大鼠中，這些改善減弱。開放場實驗顯示，與對照組相比，模型組大鼠運動參數(shù)降低，包括中心區(qū)停留時間、移動距離以及進入中心區(qū)次數(shù)。HHXYT處理有效改善運動參數(shù)，但在ABX_HHXYT組中未顯示明顯作用。綜上，這些結(jié)果表明，腸道菌群部分介導了HHXYT對PMS的治療作用。

圖5 腸道菌群部分介導HHXYT對PMS的治療作用。（A）動物實驗設(shè)計。（B-E）HHXYT調(diào)節(jié)性激素水平的作用（B：血清E2；C：血清PROG；D：卵巢E2；E：卵巢PROG）。（F）大鼠海馬Nissl染色代表性圖像以及CA1、CA3區(qū)域神經(jīng)元數(shù)量。CA1為海馬角1區(qū)，CA3為海馬角3區(qū)。（G）開放場實驗中的代表性運動軌跡、移動距離、中心區(qū)停留時間及進入中心區(qū)次數(shù)。結(jié)果以均值±SEM表示（每組n=6），兩組比較采用非配對Student t檢驗評估統(tǒng)計學顯著性（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001）。

HHXYT在離體條件下調(diào)節(jié)腸道菌群生長并維持其組成穩(wěn)定性

為進一步探究HHXYT如何直接影響腸道菌群，研究對大鼠盲腸內(nèi)容物進行離體培養(yǎng)，以評估其對微生物生長和組成的影響。與對照組相比，10 mg/ml HHXYT在6 h至18 h期間促進腸道菌群生長，尤其是在12 h時最為明顯。然而，10 mg/ml HHXYT在24 h至48 h期間抑制腸道菌群生長，尤其是在36 h時更明顯?？傮w而言，10 mg/ml HHXYT對離體腸道菌群生長表現(xiàn)出先促進后抑制的作用。

隨后，研究利用16S rRNA測序分析兩個關(guān)鍵時間點（12 h和36 h）的共培養(yǎng)樣本。在對照組中，α多樣性和β多樣性隨時間增加，而HHXYT_12h組與HHXYT_36h組之間這兩項指標保持穩(wěn)定，提示HHXYT有助于維持菌群結(jié)構(gòu)連續(xù)性。這種穩(wěn)定化伴隨著微生物組成改變。HHXYT暴露36 h后，與Control_36h組相比，Enterococcaceae、Lactobacillaceae和Streptococcaceae的相對豐度升高，而Bifidobacteriaceae、Morganellaceae、Veillonellaceae、Bacteroidaceae和Tannerellaceae降低。隨后，屬水平熱圖分析直觀展示了這些分類學變化。

此外，LEfSe分析在四組之間鑒定出顯著的腸道菌群組成差異，并在不同分類層級上揭示了28個具有分類學差異的特征。對照組顯著富集Lactobacillus、Bacteroides和Bifidobacterium等屬。相比之下，HHXYT組顯著富集常與腸道菌群失衡相關(guān)的屬，尤其是Enterococcus和Streptococcus。物種差異分析進一步驗證了上述微生物群落差異?？傮w而言，這些發(fā)現(xiàn)表明，HHXYT可在離體條件下調(diào)節(jié)腸道菌群的生長和組成，促進結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，并選擇性富集特定細菌類群。這種調(diào)節(jié)作用可能有助于其在體內(nèi)恢復腸道菌群穩(wěn)態(tài)，并部分介導其治療PMS的效應。

圖6 HHXYT在離體條件下調(diào)節(jié)腸道菌群生長并穩(wěn)定其組成。（A）HHXYT與腸道菌群體外交互實驗設(shè)計流程圖。（B）不同濃度HHXYT處理后大鼠腸道菌群生長曲線。（C）以Sobs和Shannon指數(shù)表示的α多樣性。組間差異采用單因素方差分析判定（*p<0.05，***p<0.001）。（D）OTU水平PCA分析。（E）科水平腸道菌群變化（群落柱狀圖分析）。（F）屬水平群落熱圖分析。（G）LEfSe分析。分析范圍從門到種水平，LDA>2。柱狀圖顯示各組中LDA得分最高的前10個特征。（H）物種差異分析（Kruskal-Wallis H檢驗柱狀圖）。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示（每組n=3），*p<0.05，***p<0.001。

經(jīng)腸道菌群代謝的HHXYT有助于緩解炎癥、氧化應激和激素失衡

為研究腸道菌群對HHXYT體外藥效的影響，研究采用經(jīng)腸道菌群代謝的HHXYT處理PMS相關(guān)靶細胞。細胞分為對照組、模型組、Bac組和HHXYT_Bac.組。LPS刺激顯著升高模型組炎癥因子Tnfα、Il1β以及催化NO生成的Inos的mRNA表達水平。有趣的是，經(jīng)腸道菌群代謝的HHXYT顯著降低BV-2細胞和RAW 264.7細胞中上述mRNA水平；而在KGN細胞和大鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞中，僅Inos mRNA水平在Bac組與HHXYT_Bac.組之間存在顯著差異。

由于卵巢顆粒細胞中的氧化應激和炎癥會影響卵巢功能，研究進一步采用CTX誘導的KGN細胞氧化應激模型探索HHXYT作用。在模型組中，與對照組相比，SOD活性和GSH含量顯著降低，而ROS mRNA水平升高。經(jīng)腸道菌群代謝的HHXYT顯著提高KGN細胞中的GSH水平，并降低ROS mRNA水平。研究還發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組FSH水平較低、LH水平較高，提示該模型中出現(xiàn)激素失衡；HHXYT_Bac.組則顯示這兩種激素呈逆轉(zhuǎn)趨勢。

為進一步闡明觀察到的治療作用所對應的生物活性成分，研究對腸道菌群與HHXYT共培養(yǎng)所得上清液進行化學成分分析。共鑒定出101種化合物，包括35種三萜、32種黃酮、10種有機酸、9種單萜、8種酞內(nèi)酯以及其他成分。值得注意的是，雖然竹葉柴胡來源成分在入血原型成分中缺失，但在共培養(yǎng)上清液中檢測到該藥味來源成分，提示微生物生物轉(zhuǎn)化可能增強其生物利用度。

為識別腸道菌群產(chǎn)生的具體生物活性代謝物，研究采用Q-TOF-MS/MS分析比較HHXYT在離體共培養(yǎng)前后的化學譜。通過與標準品匹配保留時間、MS1以及MS/MS碎片模式，明確鑒定出三種來源于竹葉柴胡的化合物：原柴胡皂苷元A、原柴胡皂苷元F和柴胡皂苷元F。這些柴胡皂苷代謝物由親代柴胡皂苷在腸道微生物酶作用下脫糖基形成。

隨后，研究在LPS刺激下的四種PMS相關(guān)細胞模型中評估這三種化合物的抗炎作用。在BV-2細胞中，10 nM原柴胡皂苷元A、10和100 nM原柴胡皂苷元F以及10和100 nM柴胡皂苷元F均顯著降低LPS誘導的Tnfα mRNA表達；三種化合物在10和100 nM濃度下均顯著降低Inos表達。在RAW264.7細胞中，100 nM原柴胡皂苷元F和10 nM柴胡皂苷元F顯著降低LPS誘導的Inos表達。在大鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞中，100 nM原柴胡皂苷元F顯著降低LPS誘導的Tnfα表達。在KGN細胞中，100 nM原柴胡皂苷元F顯著降低LPS誘導的NOS2表達。在三種代謝物中，原柴胡皂苷元F在多種細胞類型中表現(xiàn)出最一致的抗炎活性，提示其可能是HHXYT經(jīng)腸道菌群代謝生成的關(guān)鍵生物活性代謝物之一。盡管這些結(jié)果突出了可能負責抗炎和激素調(diào)節(jié)作用的候選代謝物，但仍需進一步開展靶向定量和藥理學驗證，以確立因果性的結(jié)構(gòu)—活性關(guān)系。

圖7 經(jīng)腸道菌群代謝的HHXYT有助于緩解炎癥、氧化應激和激素失衡。（A）HHXYT與腸道菌群相互作用產(chǎn)生的代謝物作用于細胞實驗的流程圖。（B-E）HHXYT與腸道菌群相互作用產(chǎn)生的代謝物對PMS相關(guān)靶細胞中LPS誘導炎癥因子表達水平的影響（B：BV-2細胞；C：RAW 264.7細胞；D：大鼠子宮內(nèi)膜上皮細胞；E：KGN細胞）。（F-H）HHXYT與腸道菌群相互作用產(chǎn)生的代謝物對KGN細胞氧化應激的影響（F：SOD活性；G：GSH含量；H：ROS相對表達水平）。（I-J）HHXYT與腸道菌群相互作用產(chǎn)生的代謝物對KGN細胞激素紊亂的影響（I：FSH含量；J：LH含量）。數(shù)據(jù)以均值±SEM表示（每組n=3），多組比較采用單因素方差分析評估統(tǒng)計學顯著性（*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001：對照組與模型組比較；<0.05，#<0.01，##<0.001：HHXYT_Bac.組與Bac.組比較）。

【Citation】:Wei W, Li M, Chen K, et al. Mechanistic study on the holistic actions of Hong-Hua-Xiao-Yao Tablet in alleviating premenstrual syndrome in rats.Phytomedicine. Published online April 5,2026.

【貢獻】★★★★★

本研究表明，HHXYT通過系統(tǒng)性機制和微生物組介導機制的整合緩解PMS。入血成分，尤其是甘草來源成分，可直接降低神經(jīng)炎癥。與此同時，HHXYT可恢復腸道菌群穩(wěn)態(tài)，從而產(chǎn)生經(jīng)菌群代謝的代謝物，緩解外周炎癥、氧化應激和激素失衡。總體而言，這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)了宿主—菌群相互作用對HHXYT整體療效的重要貢獻，并為中藥作用機制提供了整體性視角。此外，本研究所采用的多組學方法也為解析中藥復方復雜機制提供了可參考的策略。

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