Science丨瞬時RNA結構介導的聚合酶受困機制促進H5高致病性禽流感病毒的形成

撰文｜雪月

高致病性禽流感病毒（ highly pathogenic avian influenza viruses,HPAIVs）的產生，是流感病毒進化與跨宿主傳播研究中的核心問題之一。長期以來，研究領域已明確： H5 和 H7低致病性禽流感病毒（ low pathogenic avian influenza viruses,LPAIVs）向高致病表型轉化的分子標志，是血凝素（ hemagglutinin,HA）基因裂解位點區域獲得 furin-cleavable multibasic cleavage site （MBCS） 。該位點的形成使 HA 前體蛋白可被廣泛分布的 furin 樣蛋白酶切割，從而突破原有對局部組織蛋白酶的依賴，賦予病毒系統性擴散能力，并最終導致家禽中的嚴重致病性。盡管這一分子標志在數十年前已被確定，但 MBCS 相關插入突變究竟如何產生 ，始終缺乏令人信服的機制性解釋。

來自荷蘭伊拉斯謨大學醫學中心的Mathilde Richard團隊在 Science 上發表題為 Polymerase trapping as the mechanism of H5 highly pathogenic avian influenza virus genesis 的文章。 該研究表明，H5高致病性禽流感病毒多堿基裂解位點的形成，并非隨機插入所致，而是由血凝素裂解位點附近特定序列與瞬時RNA結構共同作用，導致病毒聚合酶在復制過程中受阻、回退并發生重復復制，從而產生關鍵插入突變。

作者首先建立了一個 virus-free influenza replication system ，僅重建流感病毒最小復制單元（ RdRp 復合體、 NP 以及 HA RNA 模板），從而避免完整病毒復制中蛋白功能選擇和病毒適應性篩選對插入事件檢測的干擾。隨后利用 circular next-generation sequencing 對 HA 裂解位點區域的低頻插入突變進行高精度檢測。實驗結果顯示，在 H5 低致病病毒典型裂解位點（ RETR ）背景下，插入事件極為罕見；當該位點被替換為更富含嘌呤、被認為更易產生多堿基裂解位點的序列（如 RKKR ）時，插入頻率顯著升高，并主要集中在 HA cleavage site 附近。

為進一步檢驗 RNA 結構在插入形成中的作用，作者對預測的瞬時 RNA 模板結構進行定向突變。首先通過改變裂解位點上下游序列， 破壞預測中的 1043–1048 cRNA transient structure 。在這一背景下， heteropolymer insertions 和較大插入事件的頻率顯著下降。相反，當研究者通過序列替換 穩定該結構的堿基配對 時，插入頻率明顯升高，尤其是產生 MBCS 相關序列的 heteropolymer insertions 顯著增加。這一結果表明，裂解位點的插入不僅依賴于局部 A/U-rich 模板序列，還依賴于復制過程中形成的特定 RNA 結構。

為了確定插入產生的復制方向，作者進一步構建 unidirectional replication system ，分別限制 vRNA→cRNA 或 cRNA→vRNA 復制過程。結果發現，當僅允許 cRNA 復制為 vRNA 時， heteropolymer insertions 仍然高頻出現；而當該復制方向被阻斷時，插入頻率顯著下降，說明這些插入主要在 cRNA -to- vRNA replication 過程中產生，與 1043–1048 結構在 cRNA 中的形成位置一致。

最后，為獲得直接結構證據，作者設計了能夠穩定形成 template-in/template-out stem 的 RNA 模板，并利用 cryo-electron microscopy 解析流感病毒聚合酶復制復合物的結構。在該結構中可以觀察到模板 RNA 在聚合酶外部形成 stem 樣結構，同時伴隨模板 - 產物鏈的 backtracking 構象 。這一結果提供了直接的結構證據，表明瞬時 RNA 結構能夠在復制過程中限制聚合酶移動，從而誘導序列重復復制并產生插入突變。

該研究表明高致病性禽流感病毒多堿基裂解位點的獲得，源于易發生插入的RNA序列與瞬時RNA結構的共同作用，這種機制不僅解釋了相關插入為何罕見且主要局限于H5和H7亞型，也提示類似的聚合酶受困結構可能影響其他負鏈RNA病毒的復制或轉錄。

原文鏈接：https://doi.org/10.1126/science.adr6632

制版人： 十一

學術合作組織

（*排名不分先后）

戰略合作伙伴

（*排名不分先后）

轉載須知

【原創文章】BioArt原創文章，歡迎個人轉發分享，未經允許禁止轉載，所刊登的所有作品的著作權均為BioArt所擁有。BioArt保留所有法定權利，違者必究。

BioArt

Med

Plants

人才招聘

點擊主頁推薦活動

關注更多最新活動！