Mol Cell丨eccDNA形成的新機制——DNA損傷誘導i-loop形成

撰文丨啾啾椰

eccDNA( extrachromosomal circular DNA ， 染色體外環狀 DNA ) 是一種游離于真核生物細胞核染色體之外的環狀 DNA 分子，廣泛存在于各種正常和腫瘤細胞中【1】。 eccDNA 大小從 幾十個堿基到數十萬個堿基對不等，通常為單鏈或雙鏈閉合環狀。 這種 DNA 在 正常細胞中普遍存在，但在腫瘤細胞中拷貝數顯著升高。 由于結構開放 、轉錄活性高， 又 常攜帶完整的癌基因（如 MYC 、 EGFR ）， eccDNA 能 通過增加拷貝數在多種癌癥中驅動基因的過度活化 。而 因其特異性地存在于癌細胞且在血液中較為穩定， eccDNA 有望成為癌癥液體活檢和伴隨診斷的分子標志物【2】。

過去的模型認為， eccDNA 主要來自雙鏈斷裂后的 DNA 片段重新連接 ， 也就是染色體發生 DSB ，斷裂片段被切下來，再通過連接形成環狀 DNA【3】。然而，這個模型不能很好解釋 為什么 大 量 eccDNA 來自重復序列區域，比如端粒、著絲粒附近的 alpha satellite 、 rDNA 和轉座元件等【4】。重復序列天然具有同源性，長期以來被認為容易發生重組，但具體怎樣從重復序列變成 eccDNA 并不清楚。

近日，來自意大利技術研究院的YlliDoksani團隊 在Molecular Cell上發表題為Damage-inducedi-loops generateeccDNAfrom repetitive elements的文章， 提出了一個新的機制：單鏈DNA損傷可以在重復序列中誘導internal loop(i-loop)，這些i-loop隨后被切除，形成eccDNA。

文章首先要解決的問題是， 重復序列中的 eccDNA 是否一定需要雙鏈斷裂產生？作者分別用 sgRNA 靶向端粒重復序列和 alpha satellite 重復序列，然后用二維凝膠電泳檢測 DNA 結構。當單鏈損傷被引入端粒或 alpha satellite 區域后，二維凝膠上出現了 代表 i -loop 結構的弧形信號（圖2）。 作者還進一步發現用 Cas9 或 TRF1-FokI 產生 DSB （雙鏈斷裂） 時，并不能有效誘導 i -loop ，這說明 i -loop 形成主要由單鏈損傷驅動，而不是 DSB 的副產物。

圖 2: 單鏈 DNA 損傷后，重復序列區域的 i -loop 結構積累。

接下來， 作者 把分離出來的基因組 DNA 用低劑量 DNase I 處理。低劑量 DNase I 可以產生 nick 或短的單鏈 gap 。結果顯示，在 alpha satellite 區域，同樣可以檢測到 damage-dependent 的 i -loop 弧形信號，而泛基因組探針并沒有看到類似信號。這說明 i -loop 并不會出現在全部基因組中，而在重復序列中特意出現； 當重復序列中兩個位置暴露出互補的單鏈區域時，它們可能靠同源配對就能形成 i -loop 。

為了直接看到這些 i -loop 結構，作者使用電子顯微鏡觀察 alpha satellite DNA 。 電子顯微鏡觀察顯示，在損傷后的 alpha satellite 富集樣品中，不僅有 i -loop ，還有明顯增加的環狀 DNA 分子（圖3），并且這種環狀分子可以被增強的 DNA 連接酶增加 。 這說明 這些 i -loop 真的變成 了 eccDNA 。

圖 3: 電鏡檢測到的受損重復序列處 eccDNA 的形成

然后作者把問題推進到一個更生理相關 的 細胞凋亡 場景 ，發現 凋亡過程中 i -loop 形成與 caspase 活性相關，很可能與 CAD 引起的 DNA 單鏈損傷或 gap 積累有關。 他們使用 長讀長 Nanopore 測序做全基因組層面的 eccDNA 來源分析 ， rDNA 、 satellite DNA 、 retrotransposons 等重復元件在 eccDNA 中顯著富集。 也據此提出， 重復序列由于具有同源性，在單鏈損傷后更容易形成 i -loop 并被切除，因此是 eccDNA 的重要來源。 最后，作者把這個機制聯系到腫瘤中的大型 ec c DNA 。 由于大型 ec c DNA 超過了二維凝膠和 EM 可以直接觀察的大小范圍，作者沒有直接檢測這些結構，而是分析了公開腫瘤 ec c DNA 數據中的斷點附近是否富集重復序列。 他們 發現 e c cDNA 事件中，斷點兩側更容易出現同一家族的重復元件 。 作者因此提出，i-loop機制不僅能解釋小型eccDNA的產生，也可能通過遠距離重復序列相互作用，參與更大型eccDNA的形成。

綜合來看，這篇文章提出了一個區別于傳統DSB-ligation模型的eccDNA生成機制。傳統模型強調雙鏈斷裂后DNA片段重新連接，而這篇文章強調單鏈損傷在重復序列中暴露同源區域，使DNA形成i-loop，隨后i-loop被切除并封閉，生成eccDNA。這個機制的重要性在于，SSB和gap在細胞中遠比DSB常見，而且人類基因組中大約一半由重復序列構成，因此這種機制可能非常普遍。

制版人： 十一

參考文獻

1. Shibata, Y., Kumar, P., Layer, R., Willcox, S., Gagan, J.R., Griffith, J.D., and Dutta, A. (2012). Extrachromosomal microDNAs and chromosomal microdeletions in normal tissues.Science336, 82–86. https://doi.org/10. 1126/science.1213307.

2. Turner, K.M., Deshpande, V., Beyter, D., Koga, T., Rusert, J., Lee, C., Li, B., Arden, K., Ren, B., Nathanson, D.A., et al. (2017). Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity.Nature543, 122–125. https://doi.org/10.1038/nature21356.

3. Stephens, P.J., Greenman, C.D., Fu, B., Yang, F., Bignell, G.R., Mudie, L.J., Pleasance, E.D., Lau, K.W., Beare, D., Stebbings, L.A., et al. (2011). Massive genomic rearrangement acquired in a single catastrophic event during cancer development.Cell144 , 27–40. https://doi.org/10.1016/j. cell.2010.11.055.

4. Jones, R.S., and Potter, S.S. (1985). Characterization of cloned human alphoid satellite with an unusual monomeric construction: evidence for enrichment in HeLa small polydisperse circular DNA.Nucleic Acids Res.13, 1027–1042. https://doi.org/10.1093/nar/13.3.1027.

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