Mol Cell | 王棟/章佩君團隊解析RNA聚合酶II中的水分子網絡及其催化功能

水是生命之源，在細胞層面，水分含量占細胞總重量的70-80%，是細胞內含量最多的成分。在分子層面，水分子在基因轉錄中起到什么樣的作用一直是個謎團。盡管過去 二 十 五 年 來 ，RNA polymerase II（Pol II）的結構研究已經取得了 突飛猛進的 進展 ， 但 這 個關鍵問題始終懸而未解 。 由于分辨率限制， 我們對轉錄的理解還是以蛋白質為中心。 絕大多數結構無法 “看到“ 水分子 ， 使得這一類“看不見”的 重要 成分長期被忽視 ，我們無法了解 水分子在轉錄過程中的結構與功能。

近日，來自 美國加州大學圣地亞哥分校王棟教授團隊聯合英國牛津大學章佩君教授團隊 以及 威斯康星大學麥迪遜分校黃旭輝教授團隊 ，在 Molecular Cell 發表 題為 Sub-2 ? Cryo-EM Structures of Transcribing RNA Polymerase II Reveal Critical Roles of Water Molecules in Catalysis 的 研究論文（第一作者： 李青嶸博士 、 易剛順博士 ）。該研究解析了亞2 ? 分辨率冷凍電鏡結構，首次 揭示 了轉錄活性狀態下Pol II中的水分子網絡，并揭示了水分子 ， 這一 轉錄體系中的“暗物質” ， 在底物識別 ， 催化反應 和蛋白質相互作用 中的關鍵作用機制 （圖1， 視頻1） 。

圖1. 亞2 ?冷凍電鏡結構揭示RNA聚合酶II中水分子介導的催化與分子相互作用

視頻 1. 冷凍電鏡密度展示與水分子介導的RNA polymerase II催化及相互作用機制

背景與挑戰

RNA·聚合酶 II （RNA Pol II ） 是基因表達過程中最核心的酶之一，負責以DNA為模板合成 信使 R NA，是轉錄過程的起點。 雖 然 20年前 通過解析 X射線晶體學結構 ， 首次揭示了在 RNA聚合酶 II處于活性狀態時 （前催化構象） ， trigger loop從開放構象轉變為閉合構象在底物識別和催化過程中的重要作用【1】。 20年來， 已 報道的 數以百計的 RNA聚合酶 II 結構中， 處于 反應 活性狀態：底物結合且 t rigger loop 處于閉合構象 的 RNA聚合酶 II 結構中 不超過4個 且 均 劣 于3 ?分辨率 。而且由于分辨率的限制， RNA聚合酶 II 的 關鍵 催化機制，尤其是質子轉移 步驟 ， 仍 是領域中 一直懸而未決 的問題 。 我們對 RNA聚合酶 II 的理解 讓只 局限于蛋白質 ，我們對 水 分子 在 轉錄機制 的作用 也 并不了解。

核心創新

盡管冷凍電鏡技術發展迅速，但受限于分辨率和取向偏好，既往 的 Pol II 結構 也 難以解析關鍵水分子及其精細相互作用。牛津大學章佩君團隊于2024年開發了單分散鏈霉親和素親和載網【2】， 用于優化顆粒取向并富集樣品。在此基礎上，通過生物素化核酸骨架并結合鏈霉親和素親和載網，顯著改善了RNA Pol II的取向分布并降低氣-液界面影響，從而解析了1.96 ?分辨率的 反應 前催化構象 結構。進一步地，研究團隊通過優化制樣流程，發展了“底物梯度親和載網”方法，在冷凍前引入底物并延緩反應激活，成功捕捉到催化中間態，并解析了磷酸二酯鍵形成 的中間催化狀態 。這些技術進展使關鍵水分子網絡得以清晰呈現，為深入理解轉錄機制提供了重要結構基礎。（圖2）

圖2. 基于 單分散鏈霉親和素親和載網 的冷凍電鏡樣品制備流程圖

關鍵發現

本研究第一次將RNA聚合酶 II 復合物在反應活性狀態反應前催化構象的 結構 的分辨率 大幅 提高 到1 .96 ?分辨率 ， 活性中心的分辨率達1 .9 2 ? 。 本結構中不但清晰解析了RNA聚合酶II各個氨基酸 在催化反應發生瞬間 的側鏈構象，更是揭示 高 達1300多的水分子。這些水分子與RNA聚合酶II形成 此前未被識別的相互作用網絡， 比溶液 中 游動的水分子穩定幾十到上千倍。 這些水分子在轉錄中起到重要作用。

1. 水分子 在 參與 底物識別和 催化反應 中發揮重要作用

首先 在底物結合區域，研究觀察到大量水分子的存在，這些水分子構建了一個此前未被識 別的相互作用網絡，顯著拓展了我們對 RNA聚合酶對 底物識別機制的理解（圖3）。傳統觀點認為，底物識別主要依賴蛋白質殘基與底物之間的直接相互作用，而本研究表明， 除了已知的直接相互作用， 更多的底物識別作用網是通過水介導的 。 水 分子作為關鍵“橋梁”，將 底物 與多個 RNA 聚合酶的 結構元件連接起來，使更多氨基酸殘基通過水介導方式參與到底物識別過程中，從而形成一個更為復雜且精細的識別網絡。

圖3. RNA聚合酶II活性中心的電子密度圖

與此同時，這些 水分子還直接參與了催化反應本身 （圖 4 ） 。在活性中心中，與金屬離子Mg2 ? A配位的水分子可作為質子受體，促進RNA引物3′-OH的去質子化，并通過連續的水分子鏈將質子傳遞至溶液環境；而位于β-磷酸附近的水分子（如W3或W4）則作為質子供體參與焦磷酸（ PPi ）的質子化過程。 這一系列水分子介導的質子轉移事件，從結構層面揭示并完善了RNA 聚合酶 II中SN2催化反應的分子機制。 更為重要的是這些水在大腸桿菌RNA聚合酶的 活性中心 也是 相當 保守的 【3】 。 這些發現 揭示了水分子在轉錄過程中所發揮的關鍵且具有進化保守性的作用。 包括水 和鎂離子 在內的反應中心可能在RNA聚合酶的進化早期就已經出現， 而蛋白質的殘基在進化中優化和穩定這個反應中心。

圖 4 水分子參與的RNA polymerase II催化SN2反應 機制

2. 水分子參與trigger loop的構象動態變化

除了在催化和底物識別中的作用外，水分子還在穩定關鍵結構元件 構象 方面發揮重要作用。其中，trigger loop （ TL ） 是位于Rpb1亞基中的一個核心結構元件， 其構象變化 在轉錄催化過程中起著至關重要的功能。 之前的結構 研究表明，當底物進入活性中心后，TL會從相對松散的 開放構象 狀態折疊 為 含 alpha-螺旋 的閉合 構 象，從而將底物穩定在反應位點附近，為催化反應提供精確的空間構型【1】。本研究的高分辨率結構 發現 ，在TL與周圍結構元件形成的界面區域中，存在大量水分子。這些水分子并非被動存在，而是與TL的構象變化過程高度耦聯：在TL折疊過程中，水分子參與形成橋接氫鍵網絡，連接TL與多個功能區域；而在TL解折疊時，這些水分子的分布也隨之發生重排或解離。這表明，水分子作為動態“橋梁”為TL的構象轉換提供了額外的結構調控層次。

3. 水分子調控 蛋白–蛋白以及蛋白–核酸相互作用

在整個轉錄復合物中，研究發現大量水分子分布于蛋白–蛋白以及蛋白–核酸相互作用界面上，其中蛋白–核酸界面的作用尤為引人關注。傳統結構研究普遍認為，核酸與蛋白的相互作用主要依賴帶正電的氨基酸殘基（如Arg和Lys）與核酸骨架上的負電荷磷酸基團之間的 直接靜電作用。然而， 這一認識在很大程度上忽視了水分子的貢獻 。本研究揭示，在RNA–DNA hybrid 區域，核酸表面被一層穩定的水化層（hydration shell）所覆蓋。這一水化層顯著拓展了蛋白–核酸相互作用的方式：水分子作為“橋梁”，通過形成水介導的氫鍵網絡，使更多類型的氨基酸殘基參與到與核酸的相互作用中，不再局限于傳統的帶正電殘基。值得注意的是，這種水介導的相互作用不僅允許負電或中性殘基參與其中，還在一定程度上緩沖和重分布了界面電荷，從而構建出更加多樣化和靈活的相互作用網絡。 基 于這一結構觀察，進一步提出， 核酸表面的水化層可能在轉錄過程中發揮“分子潤滑劑”的作用。相比于直接的蛋白–核酸接觸，通過水分子介導的相互作用在能量上更易于調節和重排，從而有助于RNA 聚合酶 II 在沿著 核酸 模版 骨架 中平滑 移動 。 這一機制為理解轉錄延伸過程中 RNA 聚合酶 II 沿著 核酸 模版鏈 快速 運動提供了新的物理基礎。

總結

本研究通過亞2 ?分辨率結構，系統性揭示了水分子在Pol II轉錄中的多重功能，不僅 闡述了 完 整的 轉錄催化機制，也打破了傳統“以蛋白為中心”的認知框架。這些發現表明，水分子是轉錄機器中不可或缺的結構與功能組成部分 。 這些發現為 RNA聚合酶催化機制提供了前所未有的機制性見解，并揭示了水分子在轉錄過程中所發揮的關鍵且具有進化保守性的作用。 此研究代 表了轉錄領域的一項重大突破，并顯著推進了對核酸酶作用機制的基礎性理解 ， 為理解核酸酶體系的普適機制提供了新的視角。 這項研究也 為 未來開展分子動力學研究和時間分辨結構分析提供了一個基礎性框架，旨在探究在轉錄過程中有序與無序水分子及離子的動態作用。

本文其他 共同 作者還 包括 吳越 （ 威斯康星大學麥迪遜分校 ） , Jenny Chong （ 加州大學圣地亞哥分校 ） Sophy Xu （ 加州大學圣地亞哥分校 ）。

原文鏈接：https://www.cell.com/molecular-cell/fulltext/S1097-2765(26)00241-8

制版人： 十一

參考文獻

1. Wang, D., Bushnell, D.A., Westover, K.D., Kaplan, C.D., and Kornberg, R.D. (2006). Structural Basis of Transcription: Role of the Trigger Loop in Substrate Specificity and Catalysis.Cell127 , 941–954. https://doi.org/10.1016/j.cell.2006.11.023.

2. Ma, J., Yi, G., Ye, M., MacGregor-Chatwin, C., Sheng, Y., Lu, Y., Li, M., Li, Q., Wang, D., Gilbert, R.J.C., et al. (2024). Open architecture of archaea MCM and dsDNA complexes resolved using monodispersed streptavidin affinity CryoEM.Nat Commun15 , 10304. https://doi.org/10.1038/s41467-024-53745-w.

3. Mueller, A.U., and Darst, S.E. (2026). Structural basis for multi-subunit DNA-dependent RNA polymerase catalytic activity.Mol. Cell6 , ??? – ??? . https://doi.org/10.1016/j.molcel.2026.03.033 .

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