突破關(guān)鍵瓶頸！復(fù)旦大學(xué)賈慧玨團(tuán)隊(duì)開發(fā)微生物組學(xué)新技術(shù)，首次實(shí)現(xiàn)復(fù)雜樣本內(nèi)原位、高精度微生物單細(xì)胞測序

復(fù)旦大學(xué)賈慧玨團(tuán)隊(duì)在國際知名學(xué)術(shù)期刊《Cell Genomics》發(fā)表一項(xiàng)突破性研究為微生物組學(xué)研究帶來了革命性的新工具。研究團(tuán)隊(duì)成功開發(fā)并應(yīng)用了一項(xiàng)基于激光誘導(dǎo)向前轉(zhuǎn)移（Laser-Induced Forward Transfer, LIFT）的技術(shù)，首次實(shí)現(xiàn)了在復(fù)雜樣本（如小鼠腸道、人類唾液乃至腫瘤組織切片）中原位、高精度地獲取單個(gè)微生物細(xì)胞，并完成高質(zhì)量的基因組或轉(zhuǎn)錄組測序。該研究能直接在原生環(huán)境中剖析微生物“個(gè)體”的基因組藍(lán)圖與基因活動(dòng)，為理解宿主-微生物互作、腫瘤微環(huán)境菌群及細(xì)菌細(xì)胞命運(yùn)決定等前沿領(lǐng)域打開了全新視野。

圖形摘要

突破技術(shù)瓶頸

傳統(tǒng)的宏基因組學(xué)提供了微生物群落的“群體畫像”，但難以區(qū)分群體中單個(gè)細(xì)胞的異質(zhì)性及其與宿主細(xì)胞的確切空間關(guān)系。尤其是對(duì)于腫瘤、胎盤等低生物量環(huán)境，或組織中占比極低的原位菌群，常規(guī)測序方法成本高昂且易受宿主DNA干擾。

LIFT技術(shù)巧妙地解決了這一難題。其原理類似于“細(xì)胞鑷子”：通過激光脈沖精確作用于載玻片上的薄層金屬涂層，產(chǎn)生的微力可將指定的單個(gè)微生物細(xì)胞（小至0.5微米）彈射到接收管中，而絲毫不傷及周圍細(xì)胞。該過程可結(jié)合熒光標(biāo)記、細(xì)胞形態(tài)或拉曼光譜進(jìn)行自動(dòng)化識(shí)別與篩選，確保目標(biāo)的唯一性。

高質(zhì)量單細(xì)胞基因組：從唾液中直接獲取完整草圖

從唾液中獲取的高質(zhì)量微生物單細(xì)胞基因組草圖

研究團(tuán)隊(duì)首先從含有數(shù)百種細(xì)菌的人類唾液樣本入手。在顯微鏡下選定目標(biāo)細(xì)菌后，LIFT技術(shù)可將其精準(zhǔn)分離，隨后進(jìn)行單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增與測序。結(jié)果顯示，由此獲得的單細(xì)胞組裝基因組質(zhì)量極高。例如，從一個(gè)唾液樣本中獲得的 Megamonas funiformis單細(xì)胞基因組，完整度高達(dá)99.99%，污染率低至0.33%，其質(zhì)量堪比實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)菌株的基因組，遠(yuǎn)超常規(guī)單細(xì)胞基因組或宏基因組組裝結(jié)果。自動(dòng)化平臺(tái)的引入，使得在一分鐘內(nèi)可精準(zhǔn)收集數(shù)十個(gè)目標(biāo)細(xì)胞，并能覆蓋唾液菌群中的所有主要門類。

自動(dòng)化微生物單細(xì)胞基因組學(xué)

揭秘細(xì)胞命運(yùn)：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組刻畫芽孢形成動(dòng)態(tài)

通過形態(tài)、光譜及單細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄組對(duì)處于孢子形成期的地衣芽孢桿菌細(xì)胞進(jìn)行一致性分組

除了基因組，該技術(shù)在高精度單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析上也表現(xiàn)出色。研究以從人唾液分離的地衣芽孢桿菌為模型，利用檸檬酸誘導(dǎo)其形成芽孢。通過LIFT技術(shù)分選不同形態(tài)的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測序，研究人員成功描繪了芽孢形成過程中細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)錄組動(dòng)態(tài)圖譜。

研究發(fā)現(xiàn)，處于不同階段的細(xì)胞，其基因表達(dá)譜和拉曼光譜特征存在顯著差異。通過轉(zhuǎn)錄組分析，研究團(tuán)隊(duì)鑒定出194個(gè)差異表達(dá)基因，并明確了在芽孢形成早期上調(diào)的基因與應(yīng)激反應(yīng)、孢子形成、水解酶活性等通路相關(guān)。更精細(xì)的分析甚至能將誘導(dǎo)第三天的細(xì)胞根據(jù)形態(tài)和轉(zhuǎn)錄組分為五類，每一類都展現(xiàn)出獨(dú)特的代謝與功能狀態(tài)。這揭示了微生物群體內(nèi)部高度的功能異質(zhì)性，而結(jié)合拉曼光譜的預(yù)篩選，可極大提高研究稀有細(xì)胞亞群的效率。

原位分析突破：直擊組織內(nèi)微生物的基因活動(dòng)

對(duì)組織中單個(gè)微生物的基因組測序

研究的最大亮點(diǎn)在于首次成功將單細(xì)胞組學(xué)分析直接應(yīng)用于組織原位菌群。在小鼠模型中，研究人員通過灌胃熒光標(biāo)記的D-氨基酸來標(biāo)記活體腸道細(xì)菌的細(xì)胞壁，隨后在結(jié)腸組織切片中觀察并LIFT分選了粘液附近乃至宿主細(xì)胞內(nèi)的單個(gè)熒光細(xì)菌，成功獲得了包括普雷沃菌、大腸桿菌、擬桿菌等典型腸道菌在內(nèi)的中高質(zhì)量單細(xì)胞基因組。

更具臨床意義的是，研究團(tuán)隊(duì)將LIFT技術(shù)應(yīng)用于一名結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織切片。在未標(biāo)記的情況下，通過形態(tài)觀察和拉曼光譜區(qū)分，研究人員精準(zhǔn)定位并分選出了一個(gè)位于腸道黏膜上的、長約1.33微米的桿狀單細(xì)胞，基因組測序鑒定其為Bacteroides intestinalis（腸道擬桿菌）。研究者還從同一癌組織樣本中分選到另一個(gè)黏附在腸黏膜上的細(xì)菌單細(xì)胞，并成功進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，該細(xì)胞被鑒定為Bacteroides xylanisolvens（解木聚糖擬桿菌）。

對(duì)該單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的深入分析揭示了其潛在的致病或代謝線索。值得注意的是，該患者有長達(dá)50年的吸煙史并伴有肺轉(zhuǎn)移，暗示了腫瘤內(nèi)菌群可能參與尼古丁代謝等過程，與宿主疾病狀態(tài)存在潛在關(guān)聯(lián)。

對(duì)組織中單個(gè)微生物的轉(zhuǎn)錄組測序

研究意義與未來展望

這項(xiàng)LIFT技術(shù)的成功應(yīng)用，標(biāo)志著微生物單細(xì)胞組學(xué)進(jìn)入了“原位”、“可視”、“精準(zhǔn)”的新階段。術(shù)未來在探索腫瘤微環(huán)境菌群功能、慢性疾病與菌群關(guān)聯(lián)、抗菌素耐藥性傳播及環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)等領(lǐng)域具有巨大潛力。通過直接“詢問”棲息在病變組織中的單個(gè)微生物“它在做什么”，有望為精準(zhǔn)診療和新型療法開發(fā)提供全新的生物標(biāo)志物和靶點(diǎn)。

https://www.cell.com/cell-genomics/fulltext/S2666-979X(25)00384-2

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