Cardiology Plus | T7 RNA 聚合酶 II 類暫停位點對 mRNA 治療藥物的影響

從疫苗到腫瘤免疫，再到心血管疾病治療，mRNA 藥物的應用版圖正在迅速擴展。然而，mRNA 藥物的研發不僅依賴于蛋白質編碼序列本身，更深層的“分子工藝學”問題往往決定了藥物的質量和產量。

近期，Cardiology Plus 2025 年第二期發表了休斯頓衛理公會醫院研究團隊的一項研究，他們關注到一個可能決定最終藥物的質量和產量但常被忽視的細節——T7 RNA 聚合酶暫停位點（pause site）。本研究旨在表征 T7 RNAP II 類暫停位點及其對 mRNA 生產的影響，以優化治療性 mRNA 的設計。

什么是暫停位點？

在體外轉錄（IVT）中，T7 RNA 聚合酶負責把 DNA 模板“抄寫”成 RNA。理想狀態下，它會一直復制到末端，生成完整的 mRNA。但如果遇到某些特殊序列，它會突然“剎車”，提前終止，這些暫停位點（pause sites）會產生流產轉錄本（abortive transcripts）。這種流產轉錄物降低了 mRNA 原料藥中治療性蛋白質的產量；并可能激活先天免疫反應；和/或產生具有脫靶效應的截短蛋白。

幾十年前，保守序列基序 ATCTGTT 被鑒定為內源性 T7 RNA 聚合酶 （RNAP） II 類暫停位點。但是，人們并不完全了解這個暫停位點對 IVT 過程的影響。

最新研究發現了什么？

休斯頓衛理公會醫院的團隊對多個 DNA 模板進行了系統研究，發現：

• ATCTGTT 可能不足以在體外誘導 T7 RNAP 轉錄終止。需要額外的下游核苷酸才能形成完整的 T7 RNAP II 類暫停位點：ATCTGTTtc、ATCTGTaaa、ATCTGTTta、ATCTGTTcc

• 暫停位點越靠近轉錄后段，影響越大，截短比例更高

• T7 RNAP 暫停位點顯著影響 mRNA 制造產量。

實驗亮點：突變讓 mRNA “滿血復活”

在一份名為“376”的序列模板中，原始版本會產生 25% 截短產物。但當研究者用同義突變替換掉 ATCTGTTt 序列后，所有截短轉錄本消失，產率和完整性大幅提升。

類似地，在另一份“406”序列模板中，電泳圖顯示沒有流產峰，暫停位點的修飾讓mRNA產量從1.5 mg/mL提升到7.3 mg/mL。這意味著，簡單的堿基替換，就能將 mRNA 工藝效率提升近 5 倍。

圖1. 對含有與不含 T7 RNA 聚合酶暫停位點的”376“模板所轉錄mRNA的分析

圖2. 對含有與不含 T7 RNA 聚合酶暫停位點的 406 條 mRNA 的分析

免疫反應：修飾比截短更關鍵

研究還關注了免疫原性。在采用N1-甲基偽尿苷修飾的mRNA處理后，不同模板的細胞因子釋放（如 IL-6）差異不大。這說明：

• 暫停位點確實影響產量和純度；

• 但免疫原性主要由化學修飾決定，而非截短片段的多少。

圖5. nGFP mRNA的免疫原性

未來展望：mRNA 藥物設計的規則

這項研究給 mRNA 藥物研發帶來了幾個重要啟示：

1. DNA 模板設計要避開暫停序列

在設計開放閱讀框時，應仔細檢查是否包含 ATCTGTT 及其變體。

2. 暫停效應與位置相關

越靠近 3’ 端，越容易生成截短產物。設計時不僅要看序列，還要看“地理位置”。

3. 優化產量與質量的低成本策略

同義突變是一種高效而安全的手段，可避免截短產物而不改變蛋白序列。

4. 未來方向：酶學改造

部分改良型 T7 RNAP（如 K179C/M750C 突變體）能夠繞過暫停位點。這為工藝開發提供了另一種思路。

結語

隨著 mRNA 技術走出疫苗賽道，向心血管、代謝性疾病等慢病領域延伸，生產工藝的“隱形障礙”不容忽視。T7 RNA 聚合酶暫停位點，就像隱藏在 DNA 序列里的“暗礁”，一旦觸發，可能讓整個生產過程效率大打折扣。

這項研究提醒我們：mRNA 藥物設計不僅是生物學問題，更是工程學問題。

在序列優化、化學修飾與酶學改造的共同作用下，未來的 mRNA 藥物將更加安全、高效，為臨床治療帶來更多可能。

引用本文：Li, Linda Hongye1; Wang, Xiaoxiao1; Yan, Qing1; Gateway, Celetta G.1; Van Meter, Bennett1; Damase, Tulsi1; Liang, Yi1; Morales, Elisa1; Domingues Bueno, Murilo T.1; McRae, Ewan K.S.1; Cooke, John P.1,*. The impact of T7 RNA polymerase class II pause sites on mRNA therapeutics. Cardiology Plus 10(2):p 99-109, April-June 2025.

DOI: 10.1097/CP9.0000000000000123

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