《Biomater. Res.》川大華西口腔李宇：3D打印細(xì)胞適應(yīng)性納米膠體水凝膠誘導(dǎo)內(nèi)源性成骨用于骨修復(fù)

研究概述

目前，臨界尺寸骨缺損的臨床修復(fù)仍面臨重大挑戰(zhàn)。自體骨移植雖被視為“金標(biāo)準(zhǔn)”，但仍存在供體有限、造成二次創(chuàng)傷及形態(tài)難以精準(zhǔn)匹配缺損部位等局限。組織工程支架雖能填充缺損區(qū)域，卻常因內(nèi)部微環(huán)境不理想而難以支持細(xì)胞在缺損中心的有效遷移、增殖與成骨分化——傳統(tǒng)多孔支架的孔壁結(jié)構(gòu)會(huì)阻礙細(xì)胞活動(dòng)，且缺乏動(dòng)態(tài)適應(yīng)細(xì)胞行為的能力。另外，依賴外源性生長(zhǎng)因子（如BMP-2）促進(jìn)骨再生的方法成本高且有安全風(fēng)險(xiǎn)。因此，亟需開發(fā)一種無需外加生物活性因子、僅通過自身物理結(jié)構(gòu)即可有效募集內(nèi)源性干細(xì)胞并誘導(dǎo)其成骨分化的新型支架材料。近年來，受天然細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）多孔、納米級(jí)和動(dòng)態(tài)可適應(yīng)特性的啟發(fā)，科研人員聚焦于構(gòu)建兼具互連納米球結(jié)構(gòu)與細(xì)胞自適應(yīng)能力的三維打印水凝膠，以期實(shí)現(xiàn)高效、安全的骨再生。

基于此，本研究團(tuán)隊(duì)開發(fā) 了一種新型3D打印的納米膠體明膠甲基丙烯酰（GelMA）水凝膠（簡(jiǎn)稱nG水凝膠），其通過GelMA與泊洛沙姆F68共混后自組裝并光交聯(lián)形成互連納米球結(jié)構(gòu)。這種細(xì)胞可適應(yīng)性的微觀結(jié)構(gòu)不僅具有優(yōu)異的孔隙連通性，還能動(dòng)態(tài)響應(yīng)細(xì)胞行為，顯著促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rBMSCs）在體外的浸潤(rùn)、遷移、鋪展及成骨分化，表現(xiàn)為堿性磷酸酶（ALP）、RUNX2、I型膠原（COL-1）和骨鈣素（OCN）表達(dá)上調(diào)及鈣結(jié)節(jié)形成增強(qiáng)。在大鼠臨界尺寸顱骨缺損模型中，無需外源性生長(zhǎng)因子，nG水凝膠即可有效募集內(nèi)源性CD29?/CD90?干細(xì)胞，顯著提升骨礦密度（BMD）和新骨再生。機(jī)制研究表明，其促成骨作用部分源于激活了整合素β1/黏著斑激酶（FAK）機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路。該研究為臨床定制化修復(fù)大段骨缺損提供了一種具有轉(zhuǎn)化前景的“生物海綿”策略。

細(xì)胞適應(yīng)性 nG 水凝膠在骨再生中的應(yīng)用 示意圖

相關(guān)研究以“Three-Dimensional Printed Cell-Adaptable Nanocolloidal Hydrogel Induces Endogenous Osteogenesis for Bone Repair”為題，發(fā)表在《Biomaterials Research》。四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院李宇教授、四川大學(xué)華西醫(yī)院茍馬玲研究員、四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院趙志河教授為其共同通訊作者。

圖文結(jié)果

Figure 1、水凝膠的制備與表征。(A) 基于DLP的3D打印示意圖。(B) nG水凝膠的個(gè)性化3D打印能力。上行，3D打印的輸入圖像；下行，3D打印nG水凝膠的光學(xué)顯微照片。(C) 展示水凝膠形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)的照片和SEM圖像。(D) nG水凝膠中納米球的尺寸。(E) 水凝膠的AFM圖像。(F) 從AFM分析獲得的Ra和Rq。(G) nG水凝膠在1.5×SBF中礦化1天前后的EDS元素映射圖像。(H) 根據(jù)EDS分析，nG水凝膠中C、O、P和 Ca 的原子百分比。

Figure 2、nG水凝膠的生物相容性和生物降解性。(A) 活/死細(xì)胞染色。(B) 水凝膠在體內(nèi)的降解行為。黑圈表示水凝膠的原始大小。(C) 根據(jù)圖2B，在降解過程中剩余的水凝膠痕跡。(D) 植入1周后水凝膠周圍皮下組織的H&E染色。(E) 活/死細(xì)胞染色的定量分析。(F) 通過CCK-8測(cè)定法確定的細(xì)胞增殖能力。(G) 植入8周后相對(duì)剩余水凝膠面積的量化。

Figure 3、nG水凝膠促進(jìn)了細(xì)胞的粘附、鋪展和遷移。(A) rBMSCs在水凝膠上培養(yǎng)3天后的粘附、鋪展和遷移情況。上行，CLSM圖像的3D和XY視圖；下行，SEM圖像。(B) rBMSCs在水凝膠內(nèi)培養(yǎng)3天后的鋪展和遷移情況。上行，CLSM圖像的3D和XY視圖；下行，SEM圖像。(C) 在nG水凝膠中通過SIM捕捉到的細(xì)胞的時(shí)間序列圖像。時(shí)間以小時(shí):分鐘表示。(D) 根據(jù)(C)所示的細(xì)胞和nG水凝膠動(dòng)態(tài)變化的示意圖。(E) 細(xì)胞在水凝膠上和內(nèi)部的粘附、鋪展和遷移的示意圖。

Figure 4、nG 水凝膠對(duì) rBMSCs 成骨分化的促進(jìn)作用。(A) ALP 和 ARS 的染色及定量分析。(B) rBMSCs 在兩周培養(yǎng)后的成骨基因表達(dá)。(C，D) nG 水凝膠中 RUNX2 和 OCN 的表達(dá)量分別升高。(E) RUNX2 和 OCN 的熒光強(qiáng)度。(F) 水凝膠中的細(xì)胞鋪展面積。(G) rBMSCs 在 nG 水凝膠中培養(yǎng)后表現(xiàn)出類似于成骨細(xì)胞的形態(tài)。

Figure 5、nG水凝膠在顱骨缺損區(qū)域招募干細(xì)胞。(A) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)示意圖。(B) CD29、CD90和SDF-1α的H&E染色和IHC染色。紅色箭頭指示陽(yáng)性表達(dá)。F，纖維；H，水凝膠。(C) CD29+和CD90+細(xì)胞的數(shù)量以及SDF-1α的表達(dá)量。

Figure 6、大鼠顱骨臨界缺損的μCT分析。(A) 從μCT分析得到的3D重建。(B) BMD和BV/TV的定量分析。

Figure 7、顱骨缺損的組織學(xué)和免疫組化染色。(A) 手術(shù)后4周和10周的H&E和Masson染色。灰色箭頭指示缺損的邊界。紅色箭頭指示水凝膠內(nèi)的新骨沉積。(B，C) 分別為手術(shù)后4周和10周的OCN和COL-1免疫組化染色。紅色箭頭指示水凝膠內(nèi)細(xì)胞周圍的陽(yáng)性表達(dá)。F，纖維；H，水凝膠；NB，新骨。

Figure 8、nG水凝膠上調(diào)ECM-細(xì)胞內(nèi)機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子。(A) 第3天在水凝膠中培養(yǎng)的細(xì)胞的整合素β1和pFAK的免疫熒光染色。(B) 第3天在水凝膠中培養(yǎng)的細(xì)胞的Itgb1和Ptk2基因表達(dá)分析。(C，D) 手術(shù)后7天和4周顱骨缺損區(qū)域的整合素β1和pFAK的IHC染色。紅色箭頭指示陽(yáng)性表達(dá)。

結(jié)論

本研究開發(fā)了一種新型三維打印的納米膠體明膠甲基丙烯酰（GelMA）水凝膠（nG水凝膠），其通過GelMA與泊洛沙姆F68自組裝形成互連納米球結(jié)構(gòu)。該nG水凝膠具有優(yōu)異的孔隙連通性和細(xì)胞自適應(yīng)微結(jié)構(gòu)，無需外源性生長(zhǎng)因子即可有效促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rBMSCs）的浸潤(rùn)、遷移、鋪展及成骨分化，顯著上調(diào)ALP、RUNX2、COL-1和OCN等成骨標(biāo)志物表達(dá)，并增強(qiáng)鈣結(jié)節(jié)形成。在大鼠臨界尺寸顱骨缺損模型中，nG水凝膠顯著招募內(nèi)源性CD29?/CD90?干細(xì)胞，促進(jìn)新骨生成，提高骨密度。機(jī)制研究表明，其促成骨能力部分源于激活整合素β1/黏著斑激酶（FAK）機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路。細(xì)胞自適應(yīng)型nG水凝膠展現(xiàn)出作為臨床可轉(zhuǎn)化策略用于個(gè)性化修復(fù)大段骨缺損的巨大潛力。

參考文獻(xiàn)

3D-Printed Cell-adaptable Nanocolloidal Hydrogel Induces Endogenous Osteogenesis for Bone Repair

Wenxin Lu、Li Li、Ruyi Wang、Yanting Wu、Yao Chen、Bowen Tan、Zhihe Zhao、Maling Gou、Yu Li

DOI：10.34133/bmr.0146

Biomaterials Research

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https://doi.org/10.34133/bmr.0146