Hans Clevers教授講述開發(fā)首個(gè)類器官背后的故事：放下預(yù)設(shè)、用心觀察、大膽求證

翻譯丨王聰

編輯丨王多魚

排版丨水成文

2009年，Hans Clevers等人使用來自小鼠腸道的成體干細(xì)胞培育出首個(gè)腸道類器官，開創(chuàng)了類器官研究時(shí)代。

2026 年 5 月 7 日，Hans Clevers 在Cell Stem Cell期刊發(fā)表了題為：How ever-expanding organoids from epithelial stem cells were developed: A hypothesis-free approach 的文章，講述了開發(fā)首個(gè)類器官的背后的故事。

我的實(shí)驗(yàn)室最初并不是為了研究腸道而設(shè)立的。我們始于免疫學(xué)，嘗試?yán)斫?T 細(xì)胞發(fā)育的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。那項(xiàng)工作引領(lǐng)我們定義了 Tcf 轉(zhuǎn)錄因子家族，并最終認(rèn)識(shí)到它們是 Wnt 信號(hào)通路的核效應(yīng)物。一個(gè)決定性的轉(zhuǎn)折點(diǎn)出現(xiàn)在 Tcf4 基因敲除小鼠展示出顯著表型時(shí)。它們未能建立腸道干細(xì)胞的區(qū)域——利貝昆隱窩（crypts of Lieberkuhn）。在深入研讀腸道生物學(xué)后，我們了解到這些隱窩完成了一項(xiàng)相當(dāng)不可思議的壯舉：它們?cè)谏拿恳恢芏紩?huì)替換掉整個(gè)腸道內(nèi)壁的上皮層，這是哺乳動(dòng)物任何實(shí)體組織中最快的自我更新過程。我們被這背后的生物學(xué)所吸引，并成功地將自己從一個(gè)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€(gè)腸道研究實(shí)驗(yàn)室。

我們當(dāng)時(shí)的信念是，Wnt 通路（特別是其在腸道中的靶基因）可以提供工具來識(shí)別這些神秘的干細(xì)胞。生理性的 Wnt 信號(hào)驅(qū)動(dòng)著腸道干細(xì)胞，而我們也曾在與Bert Vogelstein的合作中發(fā)現(xiàn)，該信號(hào)通路的突變激活會(huì)導(dǎo)致癌癥。這聽起來像是同一枚硬幣的兩面。如果我們能定義人類結(jié)腸癌中的 Wnt 靶基因程序，這可能啟發(fā)一種識(shí)別健康腸道干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法。

我實(shí)驗(yàn)室的一名成員，Marc van de Wetering，構(gòu)建了可以誘導(dǎo)阻斷 Wnt 通路的結(jié)腸癌細(xì)胞系。理論上，這將允許他通過比較誘導(dǎo)前后轉(zhuǎn)錄組來獲得一個(gè) Wnt 靶基因列表。然而，在九十年代末，小鼠或人類的基因組序列尚未被破譯。流行的方法（例如差異顯示）在我們手中沒有奏效。大約在 2000 年，斯坦福大學(xué)的 Pat Brown 發(fā)明的基因微陣列技術(shù)成為了救星。一位荷蘭合作者 Cor Verweij 當(dāng)時(shí)恰好在 Pat Brown 的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行學(xué)術(shù)休假，設(shè)法搞到了兩塊微陣列芯片。Cor Verweij詢問在 Marc van de Wetering 的結(jié)直腸癌細(xì)胞系中抑制 Wnt 后哪些基因表達(dá)下調(diào)。在阻斷 Wnt 通路后的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)分離 mRNA，從未誘導(dǎo)樣本制備的 cDNA 和誘導(dǎo)后的 cDNA 樣本用不同顏色標(biāo)記，混合后與一個(gè)包含大約 24000 個(gè) cDNA 條目的 DNA 微陣列雜交。一個(gè)腸道內(nèi) Wnt 基因的候選名單由此誕生。

與此同時(shí)，我所在的醫(yī)院在各部門和董事會(huì)之間增加了一層額外的官僚機(jī)構(gòu)。作為部門負(fù)責(zé)人，我發(fā)現(xiàn)自己陷入了一個(gè)不斷擴(kuò)張的卡夫卡式的管理者世界。2002 年，我辭去職務(wù)，并將整個(gè)實(shí)驗(yàn)室搬到了街對(duì)面的 Hubrecht 研究所，這是一個(gè)擁有百年歷史的胚胎學(xué)研究所，以 Pieter Nieuwkoop（發(fā)育生物學(xué)奠基人之一）在青蛙發(fā)育方面的工作而聞名于世。這被證明是一個(gè)絕佳的舉措。

在 Hubrecht 研究所的新大樓安頓下來后，我們孜孜不倦地研究這個(gè)候選基因列表，仔細(xì)查看表達(dá)模式，并為有希望的候選基因創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型。這最終引導(dǎo)了英國(guó)博士后 Nick Barker 鑒定出Lgr5是隱窩基底微小細(xì)胞的標(biāo)志物，這些細(xì)胞規(guī)則地散布在體積大得多的潘氏細(xì)胞之間。Nick Barker 實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵是培育了一種基因敲入小鼠，它從 Lgr5 位點(diǎn)共表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）和他莫昔芬誘導(dǎo)版本的 Cre 重組酶。GFP 使得這些微小細(xì)胞能被觀察到，而通過 Cre 酶進(jìn)行的譜系追蹤則為它們的長(zhǎng)時(shí)期干性提供了確鑿證據(jù)。Lgr5+ 干細(xì)胞后來被證明有很多令人驚訝的特性。當(dāng)時(shí)，人們普遍認(rèn)為干細(xì)胞很少分裂。然而，Lgr5+ 細(xì)胞卻持續(xù)不斷地進(jìn)行細(xì)胞周期，細(xì)胞分裂時(shí)間不到一天。這一觀察激發(fā)了幾次嘗試，試圖在器官芯片形式中培養(yǎng)上皮碎片和分離的隱窩。這些努力都失敗了。實(shí)驗(yàn)室成員并不感到意外，因?yàn)楫?dāng)時(shí)普遍認(rèn)為正常細(xì)胞無法在培養(yǎng)中長(zhǎng)期存活，更不用說增殖了。當(dāng)時(shí)認(rèn)為，只有癌細(xì)胞才能做到。

在此期間，Marc van de Wetering 學(xué)會(huì)了如何從 Nick Barker 的小鼠模型中流式分選出脆弱的 Lgr5-GFP+ 細(xì)胞。來自日本的 Toshiro Sato 隨后以博士后身份加入我的實(shí)驗(yàn)室。Toshiro Sato 在東京攻讀博士學(xué)位期間曾嘗試在 2D 培養(yǎng)中培養(yǎng)隱窩，他是實(shí)驗(yàn)室里唯一一個(gè)想再試一次的人。我們接下來制定了一個(gè)計(jì)劃。目標(biāo)是從幾個(gè)分選出的干細(xì)胞開始，使用確定的生長(zhǎng)因子來擴(kuò)增它們的數(shù)量。我聽到 Wnt 領(lǐng)域的開創(chuàng)者 Roel Nusse 在一次報(bào)告中提到，他實(shí)驗(yàn)室的博士后 Arial Zheng 試圖在培養(yǎng)中擴(kuò)增小鼠乳腺上皮細(xì)胞。Roel Nusse 強(qiáng)調(diào)，將 Wnt 激活與酪氨酸激酶受體（例如 EGFR 或 HER2）的激活結(jié)合起來是關(guān)鍵。

上皮生長(zhǎng)因子（EGF）早在 20 世紀(jì) 80 年代就已被確認(rèn)為隱窩的促有絲分裂因子，并且可以商業(yè)化獲取。激活 Wnt 則更為復(fù)雜。Roel Nusse 已經(jīng)證明，分泌型的 Wnt 蛋白經(jīng)過脂質(zhì)修飾，這使它們?nèi)芙舛鹊颓译y以生產(chǎn)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 Wnt3A 的細(xì)胞培養(yǎng)上清液可以適度激活 Wnt 信號(hào)，但必須以 1:1 的比例與新鮮培養(yǎng)基混合使用，而且它含有 10% 的血清。血清后來被證明對(duì)隱窩細(xì)胞是致命的。在尋找激活 Wnt 通路替代方法的過程中，我們轉(zhuǎn)向了 Rspondin 蛋白。Niers 和 Wu 在非洲爪蟾篩選中將其中一種 Rspondin 鑒定為 Wnt 信號(hào)的放大器。與此同時(shí)，日本釀酒公司麒麟（Kirin）一直在資助一家位于美國(guó)加州的生物技術(shù)公司 Nuvelo，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因小鼠篩選，以發(fā)現(xiàn)分泌蛋白的新功能。他們的蛋白之一，Rspondin1，產(chǎn)生了一種腸道上皮細(xì)胞高度增生的小鼠。為了開發(fā) Rspondin1 用于再生目的，Nuvelo 已啟動(dòng)一期臨床試驗(yàn)。當(dāng)我們與他們的一位科學(xué)家 Ari Abo 交談時(shí)，發(fā)現(xiàn) Nuvelo 即將關(guān)閉。Ari Abo 與我們分享了大量剩余的臨床級(jí) Rspondin1。盡管當(dāng)時(shí) Rspondin 的作用機(jī)制尚未闡明，但決定使用 Rspondin 而非 Wnt 條件培養(yǎng)基被證明是幸運(yùn)之舉。

在 Nick Barker 鑒定腸道干細(xì)胞的項(xiàng)目之外，我們一直在轉(zhuǎn)基因小鼠中操縱信號(hào)通路，以確定允許隱窩微環(huán)境支持其持續(xù)自我更新的生長(zhǎng)因子環(huán)境。我們相當(dāng)隨機(jī)地關(guān)注了包括 Notch 和 BMP 在內(nèi)的通路。雖然 Notch 通路產(chǎn)生了顯著的表型，但這些似乎與干細(xì)胞下游的命運(yùn)決定有關(guān)。探究 BMP 通路的靈感來源于 Brigid Hogan 在探討 BMP 信號(hào)在皮膚毛囊模式形成中的作用時(shí)，使用了轉(zhuǎn)基因 Noggin 等位基因。Noggin 是一種 BMP 因子的分泌型抑制劑。Ana Haramis 構(gòu)建了一種在腸道上皮中表達(dá) Noggin 的轉(zhuǎn)基因小鼠。這些小鼠表現(xiàn)出強(qiáng)烈但非常奇特的表現(xiàn)：我們注意到沿著絨毛長(zhǎng)度出現(xiàn)了許多小型隱窩。這些迷你隱窩又產(chǎn)生了它們自己的微小絨毛，形成了令人困惑的迷宮樣結(jié)構(gòu)。我們得出結(jié)論，BMP 的抑制創(chuàng)造了一個(gè)“允許隱窩形成”的環(huán)境（當(dāng)時(shí)暫時(shí)沒有更好的描述）。隨后，我們的病理學(xué)家 Johan Offerhaus 指出，這些病變與在患有幼年性息肉病（一種由 BMP 通路成分功能喪失突變引起的遺傳綜合征）的兒童身上看到的病變極為相似。Noggin 顯然是需要添加到 Toshiro Sato 的培養(yǎng)基組合中的一個(gè)候選因子。我們努力嘗試了包含三種因子的組合：EGF、Rspondin 和 Noggin。然而，還是沒有生長(zhǎng)。

我在一次研討會(huì)的茶歇中遇到了 Mina Bissell，并向她征求對(duì) Toshiro Sato 項(xiàng)目的建議。她簡(jiǎn)單地回答：Matrigel（基質(zhì)膠）。基質(zhì)膠是一種神奇但成分不明確的細(xì)胞外基質(zhì)樣提取物，它是從在小鼠腹腔中生長(zhǎng)的 EHS 肉瘤細(xì)胞中純化出來的。

確實(shí)，當(dāng) Toshiro Sato 將他的干細(xì)胞嵌入一小滴基質(zhì)膠中，在 37°C 下使其形成水凝膠，然后在無血清條件下加入三因子組合時(shí)，他觀察到了從原代隱窩（后來甚至是單個(gè)Lgr5+ 干細(xì)胞）開始的驚人擴(kuò)增。但并非預(yù)期的干細(xì)胞團(tuán)，而是出現(xiàn)了獨(dú)特的結(jié)構(gòu)：封閉的上皮囊性結(jié)構(gòu)，帶有出芽。顯微鏡觀察顯示，這些芽重現(xiàn)了隱窩的關(guān)鍵特征，在基部有干細(xì)胞和潘氏細(xì)胞。中央的管腔包含了其他主要細(xì)胞類型：杯狀細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞和產(chǎn)生激素的腸內(nèi)分泌細(xì)胞，它們都完全分化，并且其基底側(cè)位于 Toshiro Sato 后來所稱的“迷你腸道”的外側(cè)。這些結(jié)構(gòu)可以無限期地?cái)U(kuò)增，沒有表現(xiàn)出預(yù)期的端粒縮短、衰老、增殖耗竭或惡性轉(zhuǎn)化。事實(shí)上，來自單個(gè) Lgr5+ 干細(xì)胞的類器官后代可以被移植到多只小鼠體內(nèi)，產(chǎn)生持續(xù)存在的健康上皮斑塊。

偶然獲得了大量的 Rspondin1，被證明是多方面的福音。首先，高濃度的 Rspondin 在類器官培養(yǎng)中是必需的。如果不是 Nuvelo 捐贈(zèng)了他們的臨床批次，我們很可能永遠(yuǎn)無法添加所需的量。其次，我們?cè)诤芫靡院蟛虐l(fā)現(xiàn) Lgr5 是 Rspondin 的受體；其作用機(jī)制現(xiàn)在已得到充分理解。第三，小鼠潘氏細(xì)胞產(chǎn)生 Wnt3 并在其周圍形成一個(gè)陡峭的 Wnt 信號(hào)梯度。添加的 Rspondin1 會(huì)放大 Wnt 信號(hào)強(qiáng)度，但保持這種局部梯度，這就是為什么小鼠小腸類器官始終包含緊鄰其 Wnt 源（潘氏細(xì)胞）的活躍分裂的干細(xì)胞。在更遠(yuǎn)端，Wnt 信號(hào)較弱，允許祖細(xì)胞分化為其他任何細(xì)胞類型。如果我們當(dāng)時(shí)用人腸隱窩（其中潘氏細(xì)胞不產(chǎn)生 Wnt）做實(shí)驗(yàn)，就不得不結(jié)合使用 Wnt3A 和 Rspondin。那樣將不會(huì)出現(xiàn)對(duì)稱性破缺的 Wnt 梯度，而是普遍存在的強(qiáng) Wnt 信號(hào)：我們可能會(huì)得到一團(tuán)沒有任何有趣特征的祖細(xì)胞球，然后我們很可能就轉(zhuǎn)向下一個(gè)項(xiàng)目了。

自從這些關(guān)于上皮類器官培養(yǎng)的最初實(shí)驗(yàn)以來，人們學(xué)到了很多。培養(yǎng)不一定必須從純化的干細(xì)胞開始；小的組織碎片通常就足夠了。甚至可以從尿液（膀胱或腎臟）或痰液（氣道）中培養(yǎng)出類器官。經(jīng)過優(yōu)化生長(zhǎng)因子組合（即使不是全部），大多數(shù)上皮類型都可以被培養(yǎng)。這些組合無一例外地做三件事：它們強(qiáng)烈激活 Wnt，激活組織相關(guān)的酪氨酸激酶受體（例如 EGF、FGF 和 HGF），并抑制 BMP/TGF-β 信號(hào)。通常還需要額外的生長(zhǎng)因子或激素。而基質(zhì)膠仍然是提供必要細(xì)胞外基質(zhì)信號(hào)的神奇成分。

自 Toshiro Sato 在 2009 年首次描述基于組織干細(xì)胞的類器官培養(yǎng)以來，實(shí)驗(yàn)室一直在追求廣泛應(yīng)用的原理驗(yàn)證，并已擴(kuò)展到許多其他器官類型的生物學(xué)現(xiàn)象和疾病研究。在此期間，我曾擔(dān)任荷蘭皇家科學(xué)院院長(zhǎng)數(shù)年，這是一個(gè)媒體曝光度很高的角色。隨后，我共同創(chuàng)立了荷蘭首家專門治療兒童癌癥的醫(yī)院，一個(gè)非常特別的地方，叫做瑪克西瑪公主中心（Princess Maxima Center）。在過去的 7 年里，我一直在瑞士一家跨國(guó)制藥公司羅氏制藥擔(dān)任董事會(huì)成員。這是三個(gè)截然不同但都令人著迷的角色。

自從大約 50 年前我第一次踏入實(shí)驗(yàn)室以來，實(shí)驗(yàn)室的工作臺(tái)一直是我日常的錨點(diǎn)。一路走來，我學(xué)到了很多東西，但有一點(diǎn)尤為突出：不要試圖智勝大自然（don’t try to outwit Nature）。在研究一個(gè)生物學(xué)問題時(shí)，不要通過提出一個(gè)假設(shè)來讓自己帶有偏見。你總會(huì)是錯(cuò)的。大自然終將揭示她的秘密，但前提是你要保持作為一個(gè)思想開放的觀察者，并有勇氣遵循大自然的指引，即使這會(huì)讓你感到不適。

https://www.cell.com/cell-stem-cell/abstract/S1934-5909(26)00141-4