Nature |?泛素修飾不止于蛋白：非蛋白質(zhì)泛素化的系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)與檢測(cè)策略

撰文 | 阿童木

泛素化是細(xì)胞內(nèi)最為經(jīng)典的翻譯后修飾之一，長(zhǎng)期以來(lái)被認(rèn)為主要作用于蛋白質(zhì)。通過(guò)其C端甘氨酸-甘氨酸（GG）基序，泛素通常與底物蛋白賴(lài)氨酸殘基形成穩(wěn)定的異肽鍵，從而調(diào)控蛋白質(zhì)的降解、定位及功能。這一修飾體系在蛋白酶體降解、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持中發(fā)揮核心作用，構(gòu)成了細(xì)胞質(zhì)量控制與信息傳遞的重要基礎(chǔ)【1】。

然而，隨著對(duì)泛素化化學(xué)本質(zhì)認(rèn)識(shí)的加深，這一傳統(tǒng) 認(rèn)知 開(kāi)始出現(xiàn)松動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，泛素不僅可以連接至賴(lài)氨酸殘基，還能夠與半胱氨酸、絲氨酸或蘇氨酸形成硫酯鍵或氧酯鍵【2】。更進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)表明，一些E3連接酶甚至可以催化泛素與非蛋白質(zhì)分子發(fā)生共價(jià)連接，包括葡萄糖、聚糖以及多胺等代謝物 ，甚至可能涉及部分脂質(zhì)【3】（ BioArt ： ） 。 因此 ， 泛素修飾的底物范圍可能遠(yuǎn)超蛋白質(zhì)本身，延伸至細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)之中 。

然而， 這一假設(shè)始終缺乏直接證據(jù)。現(xiàn)有蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)建立在肽段分析基礎(chǔ)上，難以檢測(cè)被泛素修飾的糖類(lèi)、脂質(zhì)或小分子代謝物。對(duì)于這些底物而言，泛素與其之間往往通過(guò)酯鍵連接，這類(lèi)鍵在樣品處理過(guò)程中容易水解，使得修飾信號(hào)在進(jìn)入質(zhì)譜分析前即已丟失。因此， 非蛋白質(zhì)泛素化在生物學(xué)上可能廣泛存在，卻在技術(shù)上長(zhǎng)期處于“不可見(jiàn)”狀態(tài) ，其在細(xì)胞中的真實(shí)存在、豐度以及潛在功能始終難以評(píng)估。

近日， 澳大利亞 沃爾特和伊麗莎·霍爾醫(yī)學(xué)研究所 David Komander 和 Marco Jochem 等在 Nature 雜志發(fā)表了題為 Ubiquitination of glycogen and metabolites i n cells and t issues 的研究論文， 該研究針對(duì)非蛋白質(zhì)泛素化難以檢測(cè)的問(wèn)題， 建立了基于Ub-clipping與 sortase 標(biāo)記的質(zhì)譜分析策略，將不穩(wěn)定的酯鍵連接轉(zhuǎn)化為可富集、可 解析 的 質(zhì)譜 信號(hào) 。利用該方法，作者 系統(tǒng)鑒定了糖類(lèi)（如糖原）及多胺等非蛋白底物的泛素化修飾，并在細(xì)胞中驗(yàn)證其存在及可調(diào)控性 。該工作拓展了泛素化底物譜，提示泛素修飾參與更廣泛的代謝調(diào)控過(guò)程。

本研究的核心在于作者 利用“Ub-clipping + sortase 標(biāo)記 + LC-MS”，把原本不可檢測(cè)的非蛋白泛素化轉(zhuǎn)化為可捕獲、可富集、可測(cè)序的信號(hào) 。 具體而言， 作者首先利用特異性泛素剪切酶對(duì)泛素化底物進(jìn)行處理，將泛素從底物上切除，同時(shí)在底物分子上保留一個(gè)GG殘基。這一殘基相當(dāng)于一個(gè)穩(wěn)定的“ 化學(xué) 標(biāo)記位點(diǎn)”，可作為后續(xù)識(shí)別的分子特征。通過(guò)這一過(guò)程，原本 不穩(wěn)定的泛素-底物連接被轉(zhuǎn)化為一種可被質(zhì)譜識(shí)別的化學(xué)結(jié)構(gòu)，為非蛋白質(zhì)泛 素化的檢測(cè)提供了基礎(chǔ)。

在此基礎(chǔ)上，研究者進(jìn)一步引入分選酶（ sortase ）標(biāo)記步驟。分選酶能夠識(shí)別GG殘基，并將其轉(zhuǎn)化為帶有肽段特征的分子結(jié)構(gòu)，使原本屬于糖類(lèi)或小分子的底物獲得“ 類(lèi)肽屬性 ”。這一轉(zhuǎn)化使其能夠進(jìn)入蛋白質(zhì)組學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)分析流程，包括固相富集與高靈敏度納流液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)。通過(guò)這一“ 從小分子到肽”的轉(zhuǎn)換 ，非蛋白質(zhì)泛素化首次被納入成熟的質(zhì)譜分析體系之中。

為驗(yàn)證該方法的可行性，作者首先在體外體系中構(gòu)建了多個(gè)模型底物。以E3連接酶HOIL-1L為代表， 作者 成功制備了泛素化的寡糖及糖原，并通過(guò)酶解與剪切處理，將其轉(zhuǎn)化為帶有GG標(biāo)記的寡糖分子。這些產(chǎn)物在質(zhì)譜中表現(xiàn)出明確的保留時(shí)間及特征性碎裂模式， 表明 該策略 能夠穩(wěn)定識(shí)別非蛋白質(zhì)底物上的泛素修飾 。更重要的是，原本難以分析的高分子糖原，在經(jīng)過(guò)酶解后也可被轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)的小分子片段，從而實(shí)現(xiàn) 對(duì)復(fù)雜底物的間接解析 。

在完成方法建立后，研究進(jìn)一步轉(zhuǎn)向細(xì)胞體系驗(yàn)證。作者通過(guò)構(gòu)建基于FKBP/FRB的化學(xué)誘導(dǎo)鄰近系統(tǒng)，在Huh7細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)HOIL-1L與糖原的定向共定位。誘導(dǎo)后，糖原富集區(qū)域出現(xiàn)明顯的泛素信號(hào)，并依賴(lài)于完整的泛素化系統(tǒng)。利用上述質(zhì)譜策略， 作者 成功檢測(cè)到與體外實(shí)驗(yàn)一致的GG標(biāo)記寡糖分子。進(jìn)一步的同位素 示蹤 顯示，這些信號(hào)來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)新合成的糖原，證明 非蛋白質(zhì)泛素化不僅可以在體外重建，而且在細(xì)胞內(nèi)真實(shí)發(fā)生 。

在此基礎(chǔ)上，作者開(kāi)始探討這一修飾的潛在功能。研究發(fā)現(xiàn)，泛素化糖原可與溶酶體標(biāo)志物L(fēng)AMP1發(fā)生共定位，而不與內(nèi)體標(biāo)志物EEA1重疊。溶酶體抑制劑處理可顯著增強(qiáng)這一共定位現(xiàn)象，而抑制泛素化過(guò)程或破壞HOIL-1L催化活性則阻斷該過(guò)程。這些結(jié)果提示， 泛素化可能作為一種 分子標(biāo)記 信號(hào)，介導(dǎo)糖原向溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn) 。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明， 泛素化并不導(dǎo)致糖原形成不溶性聚集體，而是維持其動(dòng)態(tài)特性，并伴隨總體糖原水平的下降，提示其參與降解過(guò)程 。

這一發(fā)現(xiàn)將泛素化功能從蛋白質(zhì)質(zhì)量控制拓展至代謝物處理領(lǐng)域。進(jìn)一步研究顯示，在糖原結(jié)構(gòu)異常的模型中，這一機(jī)制被顯著放大。GBE1缺陷導(dǎo)致糖原結(jié)構(gòu)紊亂并形成聚葡聚糖小體，同時(shí)伴隨泛素化水平顯著升高。對(duì)泛素系統(tǒng)的干預(yù)表明，LUBAC復(fù)合物及去泛素化酶OTULIN參與該過(guò)程的調(diào)控。這些結(jié)果將 泛素化機(jī)制與糖原代謝紊亂直接聯(lián)系起來(lái) ，提示其可能在相關(guān)疾病中發(fā)揮作用。

作者進(jìn)一步評(píng)估了非蛋白質(zhì)泛素化的組織分布及動(dòng)態(tài)變化。在小鼠多個(gè)組織中均檢測(cè)到泛素化糖原，其中肝臟和骨骼肌最為豐富。禁食實(shí)驗(yàn)揭示了這一修飾的動(dòng)態(tài)特征： 在糖原快速消耗階段，泛素化糖原相對(duì)比例顯著升高，提示其在代謝重編程過(guò)程中被優(yōu)先調(diào)動(dòng) 。值得注意的是，在特定條件下， 超過(guò)1%的細(xì)胞總泛素可連接于糖原 ，顯示其在泛素系統(tǒng)中的占比 不可 忽略 。

此外， 在大量質(zhì)譜信號(hào)中篩選后，作者不僅檢測(cè)到了預(yù)期的糖類(lèi)修飾，還鑒定出新的泛素化底物，包括甘油和精胺等小分子代謝物。代謝標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明，這些修飾與細(xì)胞代謝流密切相關(guān)，而對(duì)多胺合成的抑制則可顯著降低相應(yīng)泛素化水平。這些結(jié)果進(jìn)一步表明， 非蛋白質(zhì)泛素化并非局限于糖類(lèi)，而是廣泛存在于代謝網(wǎng)絡(luò)之中 。

綜上所述 ， 本 研究 通過(guò)方法學(xué)創(chuàng)新，將長(zhǎng)期“不可見(jiàn)”的非蛋白質(zhì)泛素化轉(zhuǎn)化為可系統(tǒng)分析的分子事件，并在細(xì)胞與動(dòng)物水平上證明其真實(shí)存在及動(dòng)態(tài)調(diào)控特性 。更重要的是，這一工作 從概念上拓展了泛素修飾的作用邊界，將其從蛋白質(zhì)層面延伸至代謝層面， 提示泛素系統(tǒng)可能參與更廣泛的細(xì)胞物質(zhì)流與代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過(guò)程 。這不僅為理解細(xì)胞代謝與蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)之間的聯(lián)系提供了新的視角，也為未來(lái)探索代謝調(diào)控與疾病機(jī)制打開(kāi)了新的方向。

https://doi.org/10.1038/s41586-026-10548-x

制版人： 十一

參考文獻(xiàn)

1. Lechtenberg, B. C. & Komander , D. Just how big is the ubiquitin system?Nat. Struct. Mol.Biol.1–4 (2024).

2. Pao, K.-C., et al . Activity-based E3 ligase profiling uncovers an E3 ligase with esterification activity.Nature556, 381–385 (2018).

3. Otten, E. G., et al. Ubiquitylation of lipopolysaccharide by RNF213 during bacterial infection.Nature594, 111–116 (2021).

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