Cell?|?西地那非（偉哥）有望治療Leigh綜合征

撰文 |咸姐

Leigh綜合征（LS）是一種嚴(yán)重且目前無藥可治的線粒體疾病，其由核基因或線粒體DNA（mtDNA）中超過100種基因的致病性變異所引起，這些基因多參與氧化磷酸化過程，導(dǎo)致細(xì)胞能量工廠——線粒體功能失調(diào)。患者通常在嬰幼兒期發(fā)病，表現(xiàn)為神經(jīng)發(fā)育倒退、肌無力、代謝危象，并在早年死亡。盡管已知多種基因如MT-ATP6、SURF1和NDUFS4的突變與LS相關(guān)，但長期以來，有效的治療手段嚴(yán)重匱乏，其主要障礙在于缺乏能夠真實(shí)模擬人類疾病、特別是mtDNA缺陷的臨床前模型。傳統(tǒng)動(dòng)物模型，如Surf1基因敲除小鼠，未能復(fù)現(xiàn)人類LS的核心神經(jīng)表型；而廣泛使用的Ndufs4基因敲除小鼠雖能模擬部分癥狀，但基于此模型提出的多種干預(yù)策略（如抗氧化劑、雷帕霉素等）在后續(xù)臨床試驗(yàn)中均未取得成功【1,2】。近年來，基于患者來源誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）的新型方法學(xué)為疾病機(jī)制研究和藥物篩選提供了新希望。先前研究已利用LS患者的iPSC分化出的神經(jīng)細(xì)胞或腦類器官，揭示了神經(jīng)元生長缺陷、鈣穩(wěn)態(tài)異常及皮質(zhì)發(fā)育受損等病理特征【3】。然而，大規(guī)模、系統(tǒng)性的藥物篩選在iPSC來源的線粒體疾病模型中尚未開展。

來自德國杜塞爾多夫大學(xué)醫(yī)院的Alessandro Prigione團(tuán)隊(duì)前期發(fā)現(xiàn)，攜帶MT-ATP6突變的LS神經(jīng)前體細(xì)胞（NPC）表現(xiàn)出線粒體膜電位（MMP）異常超極化，這一穩(wěn)定且可量化的表型為高通量藥物篩選提供了理想靶點(diǎn)。基于此，近日，該團(tuán)隊(duì)于在Cell上在線發(fā)表題為Pluripotent stem-cell-based screening uncovers sildenafil as a mitochondrial disease therapy的文章，在LS患者來源的iPSC的神經(jīng)細(xì)胞中，篩選了一個(gè)包含5,632種可進(jìn)行藥物再利用的化合物文庫，利用患者來源的2D和3D模型確定了磷酸二酯酶5型抑制劑（PDE5i）西地那非為一種可被“老藥新用”的藥物候選物，其能夠在哺乳動(dòng)物模型中延長壽命，并改善六名 LS患者的臨床癥狀，從而填補(bǔ)了LS治療領(lǐng)域的空白。

研究人員利用7名攜帶不同MT-ATP6突變的LS患者來源的NPC所呈現(xiàn)的MMP超極化表型，篩選了一個(gè)包含5,632種可再利用化合物的文庫。通過建立基于四甲基羅丹明甲酯（TMRM）強(qiáng)度的活細(xì)胞高內(nèi)涵分析（HCA），他們識(shí)別出能將該超極化MMP恢復(fù)至接近正常水平的輕度解偶聯(lián)劑，并從中鑒定出兩種PDE5i，即T-0156和鹽酸伐地那非，兩者均能在不造成細(xì)胞活力損失的情況下劑量依賴性地使MMP去極化。基于兒科用藥安全性，研究人員優(yōu)先選擇了西地那非。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，西地那非同樣能劑量依賴性地使來自不同MT-ATP6變異類型的LS NPC的MMP實(shí)現(xiàn)約16%的去極化，同時(shí)增加細(xì)胞內(nèi)ATP水平、恢復(fù)mtDNA拷貝數(shù)并改善NAD+/NADH比值。此外，超分辨率顯微成像顯示西地那非還能部分逆轉(zhuǎn)LS NPC中的線粒體嵴結(jié)構(gòu)缺陷。這些發(fā)現(xiàn)確立了西地那非作為一種能夠改善多種線粒體相關(guān)表型的候選藥物。

隨后，研究人員通過多組學(xué)分析來探究西地那非的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，LS的疾病特征涉及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、軸突生長及線粒體功能等通路，而西地那非處理可逆轉(zhuǎn)33.5%的失調(diào)分子，并影響相似的神經(jīng)發(fā)育和電子傳遞鏈通路。西地那非能夠上調(diào)神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因（如HOXA5、DBX1）和保護(hù)性蛋白BAG4，并使腦能量代謝物（肌酸、半胱氨酸）趨于正常。通過多組學(xué)網(wǎng)絡(luò)，研究人員還鑒定出20個(gè)推定靶基因，其中HOXA5和PDE5下游關(guān)鍵激酶PRKG1最為突出。同時(shí)，西地那非可隨時(shí)間動(dòng)態(tài)調(diào)控多個(gè)與增殖、突觸形成、神經(jīng)炎癥及糖代謝相關(guān)的靶基因表達(dá)。這些結(jié)果表明，西地那非通過調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)育相關(guān)通路和特定基因網(wǎng)絡(luò)，有效逆轉(zhuǎn)了LS的疾病分子特征。

進(jìn)一步地，研究人員利用兩種不同方案生成的皮層腦類器官模型，探究了西地那非對人類神經(jīng)發(fā)育的影響。結(jié)果顯示，攜帶MT-ATP6突變的LS腦類器官出現(xiàn)了神經(jīng)源性區(qū)域形成受損、早期神經(jīng)元與神經(jīng)祖細(xì)胞比例改變等神經(jīng)發(fā)育缺陷。通過單細(xì)胞核RNA測序分析，研究人員識(shí)別出多個(gè)受影響的細(xì)胞群體，并發(fā)現(xiàn)LS類器官中神經(jīng)祖細(xì)胞和未成熟神經(jīng)元群體的比例發(fā)生改變。重要的是，西地那非處理能夠糾正這些細(xì)胞群體的比例失衡，特別是對神經(jīng)祖細(xì)胞群體產(chǎn)生顯著影響，部分恢復(fù)了LS類器官中異常的細(xì)胞組成。此外，轉(zhuǎn)錄組分析也支持了西地那非對神經(jīng)發(fā)育相關(guān)通路的調(diào)節(jié)作用。這些發(fā)現(xiàn)表明，西地那非通過作用于神經(jīng)祖細(xì)胞群體，改善了LS腦類器官模型中的神經(jīng)發(fā)育缺陷。與此同時(shí)，利用皮層腦類器官切片進(jìn)行活細(xì)胞鈣成像，研究人員發(fā)現(xiàn)LS腦類器官在急性代謝應(yīng)激下表現(xiàn)出異常增強(qiáng)的鈣信號，而西地那非預(yù)處理可顯著降低該鈣信號反應(yīng)。在LS NPC中，西地那非同樣能減少由寡霉素誘導(dǎo)的鈣信號升高。機(jī)制研究顯示，cGMP類似物可模擬西地那非對MMP的恢復(fù)作用，而PRKG1抑制劑則能阻斷該效應(yīng)，表明西地那非通過PDE5-cGMP-PRKG1通路發(fā)揮作用。值得一提的是，在SURF1突變的NPC中，盡管其MMP表現(xiàn)為去極化而非超極化，西地那非依然能夠恢復(fù)其MMP，提示其作用可能不限于特定MMP改變類型。此外，西地那非顯著促進(jìn)了多種LS突變神經(jīng)元的神經(jīng)突生長。PRKG1在LS神經(jīng)元中表達(dá)下調(diào)，而敲低對照神經(jīng)元中的PRKG1可模擬LS神經(jīng)元的神經(jīng)突生長缺陷，表明PRKG1在此過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這些結(jié)果共同闡明西地那非通過調(diào)控PDE5-cGMP-PRKG1信號通路，同時(shí)改善了LS神經(jīng)模型的鈣穩(wěn)態(tài)異常和神經(jīng)突生長能力。

基于以上發(fā)現(xiàn)，研究人員評估了西地那非在動(dòng)物模型中的體內(nèi)療效及其血腦屏障（BBB）穿透能力。在Ndufs4基因敲除小鼠模型中，西地那非治療顯著延長了LS小鼠的壽命，改善了肌無力、共濟(jì)失調(diào)和能量代謝缺陷，并減少了小腦和腦干中活化的caspase-3陽性細(xì)胞和Iba1陽性小膠質(zhì)細(xì)胞，且改善了浦肯野細(xì)胞的丟失。在更接近人類病理的SURF1基因敲除豬模型中，西地那非同樣改善了新生LS仔豬的活動(dòng)力和吸吮行為，幫助其度過圍產(chǎn)期并延長生存期，同時(shí)恢復(fù)了神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志物和復(fù)合物IV的活性。在大部分治療動(dòng)物中，基底節(jié)區(qū)降低的PRKG1蛋白水平也得到恢復(fù)。此外，利用LS患者iPSC分化的BBB模型證實(shí)，西地那非及其臨床制劑能夠有效穿透LS患者的BBB。這些體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)共同表明，西地那非在哺乳動(dòng)物L(fēng)S模型中具有治療潛力，并具備中樞神經(jīng)系統(tǒng)給藥所需的關(guān)鍵穿透能力。

最后，研究人員基于西地那非在兒科疾病中的已知安全性，對六名攜帶MT-ATP6基因變異的LS患者開展了西地那非的個(gè)體化標(biāo)簽外治療。參考兒科肺動(dòng)脈高壓的用藥劑量，患者接受了低至中劑量的西地那非治療，其平均血藥濃度約1 μM，接近體外實(shí)驗(yàn)的有效濃度。經(jīng)過6個(gè)月治療，除一名患者因皮疹停藥外，其余五名患者均耐受良好。在臨床改善方面，患者的運(yùn)動(dòng)功能、肌力、吞咽能力和運(yùn)動(dòng)耐量得到提升，代謝危象的發(fā)生頻率顯著減少，部分患者甚至恢復(fù)了獨(dú)立呼吸和行走能力。尤其值得注意的是，兩名患者停藥后癥狀復(fù)發(fā)，重新用藥后再次改善，為療效提供了有力證據(jù)。由此表明，西地那非作為一種可口服、安全性相對較好的藥物，能夠顯著改善特定基因型LS患者的臨床癥狀和生活質(zhì)量。

綜上所述，本研究通過整合患者來源的iPSC模型、多組學(xué)分析、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及初步臨床觀察，系統(tǒng)地揭示了PDE5i西地那非作為治療LS的候選藥物的潛力。西地那非不僅能糾正線粒體功能、改善鈣穩(wěn)態(tài)和神經(jīng)發(fā)育缺陷，還能在動(dòng)物模型中延長壽命，并在六名患者中顯示出初步的臨床獲益。這些發(fā)現(xiàn)為線粒體疾病的藥物再利用提供了重要范例，并為后續(xù)的臨床試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2026.02.008

制版人： 十一

參考文獻(xiàn)

1. Baertling, F., Rodenburg, R.J., Schaper, J., et al. (2014). A guide to diagnosis and treatment of Leigh syndrome.J. Neurol. Neurosurg.Psychiatry85, 257–265.

2. Henke, M.T., Prigione, A., and Schuelke, M. (2024). Disease models of Leigh syndrome: From yeast to organoids.J. Inherit. Metab. Dis.47, 1292–1321.

3. Tolle, I., Tiranti, V., and Prigione, A. (2023). Modeling mitochondrial DNA diseases: from base editing to pluripotent stem-cell-derived organoids.EMBO Rep. 24, e55678.

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