APPS | 優化TRIzol-硅膠柱法提取DSS結腸炎模型RNA：解決PCR抑制問題

本文系Agricultural Products Processing and Storage原創編譯，歡迎分享，轉載請授權。

1

Introduction

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）的臨床表現，其特征是慢性特發性炎癥局限于結腸黏膜，其發病機制尚不完全闡明。近年來，在闡明UC的致病機制和開發治療干預方面取得了重大進展，這在很大程度上得益于各種實驗模型的應用。TNF-α和IL-6都是促炎細胞因子中的關鍵介質，它們與IBD的發病機制廣泛相關，主要是通過它們能夠放大粘膜炎癥和損害上皮屏障完整性。針對促炎細胞因子的治療干預已被證明可以減輕腸道病變；此外，TNF-α和IL-6在推動疾病進展方面的協同相互作用進一步支持了它們作為IBD管理的雙重治療靶點的候選資格。

葡聚糖硫酸鈉（DSS）最初由Okayasu等于1990年引入，現已成為誘導實驗性結腸炎的最廣泛使用的化學試劑之一。在3～5個周期內重復口服DSS可可靠地誘發小鼠慢性復發性結腸炎，其特征是體重進行性減輕和結腸長度顯著縮短。該模型在炎癥性病變的發展中具有很高的可重復性和均勻性，特別是在遠端結腸內，從而為研究結腸炎的病理生理機制和評估治療干預措施提供了強大的平臺。DSS，特別是分子量為40 kDa的DSS，已被證明在口服給藥后穿過腸粘膜屏障并在各種組織中積累。DSS在暴露后24 h內定位于結腸巨噬細胞、腸系膜淋巴結和肝臟Kupffer細胞。到第3天，可以在脾臟巨噬細胞中檢測到DSS，反映全身播散。

定量聚合酶鏈反應（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一種廣泛采用的技術，用于評估DSS誘導的結腸炎模型中促炎細胞因子的表達。然而，該方法的準確性和可重復性可能會受到與DSS相關的干擾的嚴重影響。先前的研究表明，DSS對逆轉錄酶和Taq聚合酶活性均具有劑量依賴性抑制作用，而Tween 20等非離子表面活性劑的加入無法減輕這種抑制作用，從而使DSS處理組織中的下游qPCR分析復雜化。因此，確定一種可靠、經濟高效且直接的方法來減輕DSS介導的抑制對于提高該模型中基因表達研究的準確性具有相當重要的意義。

2

PCR：在評估加工食品和人類健康中的概述和應用

PCR是一種重要的分子生物學技術，用于擴增特定的DNA序列，使研究人員能夠精確有效地檢測和分析遺傳物質。該反應需要DNA模板、序列特異性引物、脫氧核苷酸三磷酸（dATP、dTTP、dCTP和dGTP）、緩沖反應環境和耐熱DNA聚合酶（最常見的是Taq聚合酶。DNA合成沿5'至3'方向進行，酶通過沿模板鏈摻入互補的dNTP來延伸引物。qPCR是一種通過靶序列的指數擴增來定量核酸的高靈敏度方法。該過程涉及循環變性、引物退火和Taq聚合酶延伸，從而能夠通過基于熒光的探針或染料進行實時檢測。

PCR已成為食品安全和質量控制中不可或缺的工具，通過擴增物種特異性核酸序列，可以快速、靈敏和特異性地檢測主要食源性病原體，如沙門氏菌屬、單核細胞增生李斯特菌和大腸桿菌O157:H7。這些分子技術能夠及早識別和定量微生物污染物，從而支持法規遵從性和公共衛生保護。這加快了污染篩查，降低了消費者的風險，并支持法規遵從性。PCR還可以確保食品的真實性和可追溯性，從而檢測肉類或魚類產品中的意外物種，并識別食品欺詐或過敏原污染案例，以保護敏感個體。由于其速度、靈敏度和精度，PCR已成為食品生產質量控制不可或缺的一部分。它使食品公司能夠監控制造過程的每個階段，并有助于降低污染和代價高昂的召回風險。隨著技術的不斷進步，qPCR有望變得更加高效，進一步加強全球食品安全體系。

qPCR在人類健康和醫學研究中也發揮著變革性作用。例如，高通量qPCR能夠以極快的速度和準確度同時處理數千個樣本，從而徹底改變了基因組分析。這種能力在群體遺傳學、疾病監測和環境研究中特別有價值。集成到高通量系統中的自動化和機器人技術減少了體力勞動，提高了可重復性，并加快了結果，使復雜的遺傳分析能夠應用于更廣泛的科學和臨床領域。在生物安全和公共衛生領域，高通量qPCR在檢測生物威脅方面發揮著關鍵作用，包括新出現的傳染源（例如SARS-CoV-2、H1N1）和環境樣本中的抗生素耐藥基因，這凸顯了其快速性和便攜性，在疫情監測和大流行準備中具有重要價值。在臨床診斷中，將傳統的機器學習技術與基于qPCR的驗證相結合，以發現胰腺癌的穩健治療靶點，促進精準醫療和靶向治療。特別是，qPCR被廣泛應用于研究靶基因在炎癥、代謝紊亂和微生物感染等生理和病理條件下的轉錄調控。這使其成為一種非常適合涉及細胞因子表達、生物標志物驗證和通路分析的研究的方法。其高靈敏度和相對較低的RNA輸入要求允許精確定量mRNA水平，即使在小或復雜的組織樣本中也是如此，使其成為結腸炎模型或其他炎癥相關研究中結腸組織分析的理想選擇。

3

IBD：基于qPCR的炎癥評估的機制、DSS誘導模型和挑戰

IBD包括UC和克羅恩病，是一種持續性、復發性疾病，其特征是胃腸道炎癥，全球發病率不斷上升。盡管進行了數十年的研究，但IBD的發病機制仍不完全清楚，目前尚無治愈性治療方法，這進一步給公共衛生帶來了沉重負擔，導致生活質量下降、結直腸癌風險增加和大量醫療費用。因此，迫切需要研究IBD的潛在分子機制并開發更有效的診斷和治療干預措施。為了研究免疫反應、腸道微生物群和腸上皮細胞在IBD發病機制中錯綜復雜的相互作用，研究人員經常依賴結腸炎動物模型，其中DSS誘導的小鼠結腸炎是最廣泛使用的模型之一。

DSS誘發的結腸炎仍然是研究腸道炎癥的最廣泛使用和特征最充分的模型之一，因為它簡單、可重復，并且能夠模仿人類UC的幾個關鍵特征。該模型是通過在飲用水中口服DSS啟動的，這會導致結腸上皮屏障的劑量和持續時間依賴性損傷。這種上皮破壞使管腔抗原（包括微生物產物）能夠穿透粘膜，從而引發強大而持續的免疫反應。因此，小鼠表現出結腸炎的臨床和組織學癥狀，如體重減輕、腹瀉、直腸出血、隱窩結構扭曲、粘膜潰瘍和白細胞浸潤。該模型因其快速誘導局部免疫反應而廣受青睞，從而使研究人員能夠研究腸道炎癥的起始和消退階段，這使其成為評估抗炎劑和闡明宿主對上皮損傷反應的寶貴平臺。qPCR是評估DSS誘發的結腸炎炎癥反應的核心方法，因為它可以準確定量與關鍵促炎細胞因子相對應的mRNA水平，包括TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-γ，它們是免疫激活、上皮破壞和白細胞浸潤的分子特征。qPCR因其靈敏度、特異性和成本效益而受到認可，仍然是一種廣泛使用的技術，通常與組織病理學評估和免疫測定相結合，以產生粘膜炎癥的全面概況。然而，最近引起關注的一個技術問題是殘留的DSS對下游分子測定的潛在干擾，特別是qPCR。DSS由于其高硫酸鹽含量和多陰離子性質，即使在提取后也可以在結腸組織中持續存在或與RNA樣品保持相關性。值得注意的是，已知DSS會抑制對PCR至關重要的DNA聚合酶（如Taq），它們的殘留存在可能會抑制逆轉錄或聚合酶活性，從而導致人為地降低或缺失擴增信號。DSS主要通過其高度硫酸化的多陰離子性質干擾qPCR，從而廣泛抑制核酸擴增和細胞過程。它可以與聚（U）競爭并抑制核糖核酸酶活性，而類似的天然或合成聚陰離子聚合物會破壞mRNA-核糖體相互作用并調節翻譯效率。這些綜合效應通常表現為Ct值延遲、熒光信號減弱或完全擴增失敗，最終破壞qPCR檢測的靈敏度、準確性和可重復性。事實上，數據記錄了DSS處理小鼠的結腸中qPCR信號受到抑制或檢測不到，即使細胞因子水平預計會升高（圖1），這種抑制可以通過阻止DNA擴增來干擾遺傳分析，這對在IBD研究中依賴基于PCR的方法的研究人員構成了限制。這種抑制會阻止DNA擴增來干擾遺傳分析，這對在IBD研究中依賴基于PCR的方法的研究人員構成限制。

圖1 使用TRIzol提取法對DSS誘導的結腸炎小鼠結腸組織中TNF-α的Ct值

4

克服DSS模型中傳統RNA純化方法的局限性：實現快速且經濟高效的提取工作流程

DSS作為一種親水性和強陰離子性聚合物，在RNA分離過程中傾向于與核酸共沉淀并共提取物。這種污染顯著抑制逆轉錄酶和Taq聚合酶活性，從而抑制qPCR擴增效率。為了解決這個問題，額外的RNA純化步驟對于提高RNA對下游應用的適用性至關重要。常見的方法包括雙氯化鋰（LiCl）沉淀法和精胺介導的多核苷酸激酶活性抑制。雖然LiCl沉淀可以有效去除DSS，但它通常涉及多個耗時的步驟，包括兩輪高濃度LiCl沉淀（每輪需要在冰上孵育90 min以上）以及隨后的異丙醇沉淀和乙醇洗滌過程，總處理時間可超過4 h。此外，LiCl方法對初始RNA濃度的要求相對較高，并且回收效率容易發生變化。在延長的加工過程中，還需要格外小心，以防止RNA降解。盡管增加了動手時間和RNA丟失的風險，但由于其成本效益和在大多數實驗室環境中的可及性，這種方法被廣泛采用。

在DSS污染的情況下，精胺為恢復PCR和qPCR性能提供了實用有效的解決方案。它有效地中和了DSS對DNA聚合酶和逆轉錄酶活性的抑制作用，無需勞動密集型純化步驟即可實現可靠的擴增，這使得精胺在涉及DSS誘導的結腸炎模型的工作流程中特別有利。盡管精胺能有效抵消DSS介導的抑制作用，但由于其有效范圍窄，在較高濃度下存在擴增抑制的風險，以及與其他陰離子抑制劑的潛在相互作用，其機制尚不完全清楚，因此其應用需要精確優化。

一些研究建議在TRIzol裂解或酶處理后結合聚A純化，以減輕殘留的DSS干擾，盡管這些方法相對昂貴且程序復雜。專為DSS模型設計的商業RNA提取試劑盒（QIAGEN、RNeasy Mini試劑盒或Bio-Rad ）通常無需額外的純化步驟，以加快RT-qPCR的RNA制備，從而顯著縮短了整體提取時間，但需要更高的技術精度和嚴格的實驗條件。此外，試劑盒組件的專有性限制了方案的靈活性，這促使我們開發了一種簡化、快速和高效的RNA提取方法，專為高通量或重復樣品處理量身定制。這些缺陷促使我們嘗試構建一種更加簡化、快速和高效的RNA提取方案，這在處理大量樣本或重復實驗時尤其有利。

5

DSS模型中的RNA提取：挑戰、常規局限性和在基于PCR的炎癥評估中的應用

DSS是一種高分子量硫酸化多糖，往往會在組織樣本中持續存在，從而干擾隨后的RNA提取和純化過程。DSS的分子結構特征是高度支化的多糖主鏈富含磺酸基團，賦予強烈的整體負電荷。同時，其分子骨架大且高度分支。這種結構特性使得DSS在水溶液中表現出很強的親水性和電荷排斥性，阻礙了與二氧化硅基純化基質的有效相互作用，使其無法被有效吸附或去除。相比之下，RNA中的核糖單元含有多個羥基，能夠與二氧化硅表面形成穩定的氫鍵，從而實現選擇性吸附。

本研究評估了一種優化的RNA提取方案，該方案將TRIzol試劑與基于硅膠柱的純化相結合。所提出的方法有效地解決了分子分析中常見的主要局限性，包括成本高、處理時間長和RNA質量不一致。實驗室廣泛使用的商業RNA提取試劑盒（如QIAGEN、RNeasy Mini試劑盒或Bio-Rad ,326,820）的提取成本通常在3～7美元。在大規模研究下，試劑的累積成本可能會變得可觀。相比之下，本研究開發的方案利用標準硅膠膜離心柱與堿性化學試劑（TRIzol、氯仿、異丙醇和乙醇）相結合進行RNA提取。這種適應將直接試劑成本降低到每個樣品不到1美元，顯著減輕了財務負擔。這種具有成本效益的策略對于涉及高樣品通量或長期多時間點采樣設計的動物研究特別有利。

傳統的RNA提取過程，特別是在處理由DSS誘導的結腸組織樣本時，由于去除共提取的DSS殘基，通常會引入額外的步驟。如果進行LiCl沉淀、反復洗滌或DNase處理等步驟，總提取時間將延長至4 h以上。硅膠膜柱在高鹽/醇條件下通過氫鍵和脫水選擇性地結合核酸，其中RNA的磷酸骨架和核糖羥基與表面硅醇相互作用。相比之下，DSS是一種多陰離子多糖，其高度水合的硫酸鹽基團可防止有效的脫水和二氧化硅粘附。因此，在RNA純化過程中，DSS在流通中被排除或被乙醇沖走，可能最大限度地減少其共洗脫和隨后對qPCR的干擾。

在這項研究中，使用改進的基于TRIzol的提取方案結合二氧化硅離心柱純化，從小鼠結腸組織的1 cm片段中分離出總RNA。將組織樣品置于預裝不銹鋼珠的2 mL裂解基質管中，并使用組織裂解器（MP Biomedicals）在0.5 mL TRIzol試劑中均質化，直至實現完全組織破壞。隨后，加入0.1 mL氯仿，將樣品劇烈渦旋15 s，并在室溫下孵育5 min。通過在4 °C下以11500 × g離心15 min來完成相分離。將透明上層水相小心地轉移到新鮮的無RNase管中，并與等體積的2-丙醇混合，并在室溫下孵育5～10 min。然后將混合物加載到二氧化硅離心柱上以促進RNA結合。在4 °C下以10000 × g離心3 min后，用75%乙醇洗滌色譜柱兩次，并在4 °C下再次以10000 × g離心3 min以除去殘留乙醇。通過以10000 × g離心3 min，將RNA洗脫在50 μL生物級水中（10000 × g，3 min）（圖2）。使用NanoDrop分光光度計評估提取的RNA的純度和濃度。從樣品均質化到RNA回收的總提取時間僅需約1 h，顯著縮短了作周期并提高了樣品處理通量。同時，縮短的處理時間有效地降低了RNA降解的風險，考慮到接受DSS處理的組織中RNA固有的脆弱狀態，這一點尤為關鍵。

圖2 使用TRIzol試劑比較標準和優化的RNA提取工作流程

實驗結果表明，DSS處理組的Ct值顯著降低，表明RNA模板的可用性充足，并表明這種優化的提取方法有效地減輕了DSS誘導的PCR反應抑制（圖3）。此外，DSS治療顯著上調促炎細胞因子（TNF-α）的表達（圖3），這與預期的炎癥反應一致，并進一步支持提取的RNA在下游分子分析中的可靠性。

圖3 使用優化的TRIzol-硅膠柱提取方法，DSS誘導的結腸炎小鼠結腸組織中TNF-α的Ct值

6

Conclusion

本研究開發的RNA提取方法（將TRIzol試劑與硅膠膜離心柱純化相結合）顯著降低了試劑成本和處理時間，同時保持了RNA產量和純度。這種優化的方法為DSS誘導的結腸炎模型和其他動物疾病研究中的高效、高質量RNA提取提供了一個強大且具有成本效益的方法框架。

Optimized TRIzol–silica column RNA extraction for DSS-colitis: resolving PCR inhibition

Jie Lin, Jiacheng Zhang, Adria Morales Santiago, Quancai Sun*

Department of Health, Nutrition and Food Sciences, Florida State University, Tallahassee, FL, 32304, USA

*Corresponding author.

Abstract

Dextran sulfate sodium (DSS) is widely used to induce experimental colitis in animal models, facilitating the investigation of inflammatory bowel disease (IBD). However, its strong polyanionic nature interferes with RNA extraction and suppresses reverse transcription and polymerase chain reaction (PCR) amplification, compromising downstream quantitative PCR (qPCR) analyses. Conventional RNA purification methods, such as lithium chloride precipitation and commercial kits, are limited by time, cost, and efficiency. This review outlines the key challenges associated with RNA isolation from DSS-treated tissues and presents an optimized extraction protocol integrating TRIzol with silica spin column purification. The method is systematically evaluated in mouse colonic tissues from DSS-induced colitis models, focusing on its compatibility with downstream qPCR analysis of pro-inflammatory cytokine expression.

Reference:

Lin, J., Zhang, J., Santiago, A.M. et al. Optimized TRIzol–silica column RNA extraction for DSS-colitis: resolving PCR inhibition. Agric. Prod. Process. Sto. 1, 24 (2025). https://doi.org/10.1007/s44462-025-00030-8

翻譯：田雨欣（實習）

編輯：梁安琪；責任編輯：孫勇

封面圖片來源：圖蟲創意

APPS感謝您的關注

歡迎廣大作者積極撰寫論文，踴躍投稿！

（點擊左側二維碼查看期刊主頁）