Phytochem Anal I 從“單指標”到“多維表型”：芪桂降脂方破解脂肪肝活性成分篩選難題 (李萍/王廣基/楊華-中國藥科大學)

2026年4月6日，中國藥科大學李萍、王廣基、楊華團隊在Phytochemical Analysis（中科院3區，IF=2.6）在線發表題為“Discovery of Active Compounds in Qigui Jiangzhi Formula for Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease by a Multidimensional Phenotypic Analysis”的研究論文。

該研究聚焦代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD）復雜病理進程下中藥復方活性成分難以精準識別的關鍵問題，圍繞芪桂降脂方如何通過多成分、多靶點、多通路協同調控糖代謝紊亂、脂質代謝異常、能量代謝失衡及氧化應激損傷展開系統研究。研究團隊構建了基于高內涵成像的多維表型分析策略，突破傳統單指標篩選方法的局限，成功從芪桂降脂方中鑒定出多種改善MASLD的潛在活性成分，并進一步揭示其可能通過AGE-RAGE、AMPK、HIF-1等關鍵信號通路發揮綜合干預作用，為中藥復方藥效物質基礎解析及抗脂肪肝創新藥物發現提供了新的研究范式。

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【摘要】

背景：代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD）的發病率正持續上升。臨床研究表明，芪桂降脂方（QGJZF）可通過調節糖脂代謝通路，有效改善高脂血癥及代謝相關脂肪性肝病患者的病情。

目的：本研究旨在建立一種基于多維表型特征的篩選策略，用于篩選芪桂降脂方中能夠改善糖脂代謝異常的活性成分。

方法：本研究構建了一種基于高內涵成像技術的肝細胞多維表型分析方法。該方法能夠將MASLD中的葡萄糖代謝、脂質代謝、能量代謝和氧化應激等生物學過程與細胞形態學數據進行關聯。通過將芪桂降脂方各餾分的質譜離子數據與多維表型數據相結合，并基于活性評分和聚類評分開展化學-表型相關性分析，篩選芪桂降脂方中的活性成分。進一步結合網絡藥理學分析，闡明芪桂降脂方改善MASLD的潛在作用機制。

結果：在多維表型分析獲得的199個細胞表型參數中，分別有99、51、131和76個參數與MASLD中的葡萄糖代謝紊亂、脂質代謝紊亂、能量代謝紊亂和氧化應激相關。隨后，本研究在芪桂降脂方中鑒定出23種活性成分，這些成分能夠改善葡萄糖代謝穩態、緩解脂質代謝紊亂、恢復能量代謝平衡并減輕氧化損傷。活性成分與網絡藥理學的聯合分析結果表明，其作用機制可能涉及AGE-RAGE、MASLD相關通路、AMPK和HIF-1等信號通路。

結論：本研究提出了一種多維表型分析方法，克服了MASLD傳統單指標篩選方法的局限性。利用該方法，本研究鑒定了芪桂降脂方中改善MASLD的活性成分及其關鍵作用通路。

01

研究背景及科學問題

預計到2040年，成人代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD）的患病率將高達55.7%。MASLD的發病機制具有多因素特征，而代謝紊亂所形成的惡性循環是其發生和進展的主要驅動因素。通常認為，MASLD的早期階段以葡萄糖代謝紊亂為主要特征。例如，過量攝入葡萄糖和果糖可誘導肝臟胰島素抵抗，進而損害肝臟對葡萄糖的攝取。同時，當脂肪組織中的胰島素抵抗增強脂解作用時，循環游離脂肪酸水平升高，并促進脂質在肝臟中堆積，從而導致脂質代謝紊亂。此外，蓄積的游離脂肪酸會通過加重線粒體β-氧化負擔并損害三磷酸腺苷（ATP）的生成，引發能量代謝失衡。這些事件共同導致過量活性氧（ROS）的產生和細胞損傷。因此，亟需闡明MASLD發生與進展的機制，為有效治療策略的開發提供依據。

中藥復方被認為是治療MASLD的一種有效策略。芪桂降脂方由八味中藥組成，包括黃芪、陳皮、蒼術、肉桂、決明子、澤瀉、生山楂和絞股藍。該方在MASLD治療中顯示出潛在療效。已有研究表明，其作用機制可能與激活AMPK/SIRT1信號軸有關，該信號軸可上調TFEB介導的自噬-溶酶體通路，促進肝細胞中脂滴的清除，并減少肝臟脂質蓄積。近期研究已闡明芪桂降脂方對脂質代謝紊亂的調節作用。然而，芪桂降脂方中改善葡萄糖代謝紊亂、能量代謝失衡和氧化應激的活性成分仍不明確。因此，有必要建立一種適用于MASLD多維病理過程的表征方法。

與基于靶點的篩選相比，表型篩選是新藥研發中的重要策略。表型藥物發現是指在不預先了解藥物靶點的情況下，基于可量化的表型終點篩選候選化合物。表型篩選非常適合用于中藥復方多成分體系中活性成分的發現。高內涵成像技術能夠在單次實驗甚至單個細胞水平提取數百至數千個形態學參數。高內涵成像技術所獲得的多維參數已廣泛應用于中藥活性成分的鑒定。例如，AnnoTCM平臺通過結合高內涵成像技術和代謝組學，從保元湯中鑒定出16種抗炎成分。此外，高內涵成像技術也已在斑馬魚模型中的表型藥物發現研究中得到驗證，并成功用于從仲景方中篩選抗炎化合物。因此，借助高內涵成像獲得的多維表型數據，有望全面揭示中藥復方通過多成分調控疾病多個生物學過程的作用方式。

本研究設計了一種多維表型篩選策略，用于篩選芪桂降脂方中的活性成分。該策略針對MASLD的四個關鍵病理過程，即葡萄糖代謝紊亂、脂質代謝紊亂、能量代謝紊亂和細胞氧化應激，構建了定量化的多維表型模塊。隨后，這些表型定量模塊被用于分析芪桂降脂方對多步驟病理生理過程的改善作用。通過化學-表型相關性分析，本研究鑒定出芪桂降脂方中18種可改善葡萄糖代謝平衡的化合物。同時，有19種化合物可通過調節脂質代謝紊亂緩解疾病。在能量代謝方面，有17種化合物可恢復能量代謝平衡。此外，有16種化合物可減輕MASLD中的氧化應激損傷。網絡藥理學被用于預測活性成分的潛在作用機制。結果顯示，這些化合物可通過調節AGE-RAGE、胰島素信號和胰高血糖素信號等信號級聯反應增強葡萄糖穩態；通過調控MASLD相關通路改善脂質代謝紊亂；通過協調AMPK和mTOR信號實現能量平衡；并通過激活FoxO和HIF-1通路減輕細胞氧化應激損傷。綜上，本研究通過一種高效的多維表型方法，證明了芪桂降脂方及其活性成分在MASLD治療中的調節作用。本研究認為，多維表型分析方法可應用于中藥復方活性物質的發現。

02

重要發現及亮點

3.1 高糖誘導的肝細胞代謝紊亂模型

為系統評估代謝變化，本研究采用45、50、55、60或65 mM葡萄糖處理HepG2細胞24 h。結果表明，55 mM葡萄糖能夠穩定誘導HepG2細胞發生一系列代謝紊亂，包括葡萄糖攝取受損、脂滴堆積增加、ATP含量下降以及ROS水平升高。因此，本研究選擇55 mM葡萄糖作為后續實驗的最佳誘導濃度。隨后，研究進一步考察代謝功能障礙的時間變化過程，采用55 mM葡萄糖處理HepG2細胞，并在多個時間點（0、3、6、9、12、15和24 h）評估其變化。隨著高糖暴露時間延長，代謝異常呈時間依賴性加重，提示代謝紊亂和氧化應激可能形成自我維持的惡性循環。因此，本研究選擇55 mM葡萄糖處理24 h作為后續實驗的最佳條件（圖1）。

55 mM葡萄糖誘導顯著降低了HepG2細胞的葡萄糖消耗。同時，55 mM葡萄糖可導致總膽固醇（TC）和總甘油三酯（TG）水平升高。Nile Red和油紅O染色均證實細胞內存在明顯脂滴堆積。此外，55 mM葡萄糖還觸發顯著的線粒體功能障礙，表現為線粒體膜電位（MMP）下降和ROS水平升高。綜上，這些結果證實了所建立代謝紊亂模型的有效性。

圖1 高糖（55 mM）誘導的肝細胞代謝紊亂模型。
（A）不同時間點HepG2細胞葡萄糖攝取水平的代表性熒光圖像。（B）不同時間點HepG2細胞相對葡萄糖攝取水平的定量分析（n=3）。（C）不同時間點HepG2細胞脂滴堆積的代表性熒光圖像。（D）不同時間點HepG2細胞相對脂滴堆積水平的定量分析（n=3）。（E）不同時間點HepG2細胞ATP含量的代表性熒光圖像。（F）不同時間點HepG2細胞相對ATP含量的定量分析（n=3）。（G）不同時間點HepG2細胞ROS水平的代表性熒光圖像。（H）不同時間點HepG2細胞相對ROS水平的定量分析（n=3）。統計分析中，所有數值均以均值±標準差表示。*表示模型組與對照組之間存在統計學差異。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

3.2 55 mM葡萄糖可顯著影響HepG2細胞的多維表型變化

細胞器結構和功能的完整性對于維持代謝穩態至關重要。代謝功能障礙通常與線粒體損傷、內質網應激以及線粒體-內質網接觸異常有關。根據上述方法，本研究對HepG2細胞的細胞膜、線粒體和內質網進行了多重染色。隨后，對正常組和55 mM葡萄糖組的HepG2細胞進行高內涵成像。利用Harmony 4.9軟件從三個細胞器中共提取199個表型參數，包括熒光強度、形態學特征和紋理特征。其中，細胞膜參數39個，線粒體參數80個，內質網參數80個。基于多維表型分析結果，在55 mM葡萄糖作用下，HepG2細胞中有94個表型參數發生顯著變化。為更直觀地展示多維表型差異信息，本研究采用了非線性降維技術。t-SNE是一種將高維數據轉換至低維空間的方法。結果顯示，對照組與55 mM葡萄糖組呈現明顯聚類。此外，本研究還分別分析了細胞膜、線粒體和內質網的多維表型參數，結果同樣顯示出顯著聚類。

圖2 HepG2細胞的多維表型分析。
（A）正常條件和高糖條件下HepG2細胞的表型圖像。（B）HepG2細胞表型圖像的分析流程。（C）MASLD的多維表型分析策略。（D）MASLD相關表型參數的聚類分析。（E）MASLD的多維表型圖譜。

3.3 HepG2細胞的多維表型分析

本研究將Pearson相關系數引入多維表型分析方法，用于將HepG2細胞的代謝功能變化與多維表型分析結果進行關聯。Pearson相關系數可用于衡量兩個連續變量之間線性關系的強度和方向。本研究采集了不同濃度葡萄糖刺激下HepG2細胞的高內涵成像數據。如圖2C所示，選取R2≥0.3的表型參數作為與MASLD四個關鍵病理過程密切相關的參數。隨后，分別分析多維表型參數與葡萄糖代謝紊亂（2-NBDG熒光強度）、脂質代謝紊亂（Bodipy熒光強度）、能量代謝紊亂（ATP Red-1熒光強度）和氧化應激（DCFH-DA熒光強度）之間的相關性。之后，采用t-SNE對這些高度相關的參數進行分析。

結果顯示，199個表型參數分別與葡萄糖代謝紊亂、脂質代謝紊亂、能量代謝紊亂和氧化應激存在相關性。此外，進一步對這些MASLD相關參數集進行t-SNE降維分析后，觀察到55 mM葡萄糖組與對照組之間出現明顯聚類。說明這些多維表型參數能夠有效區分HepG2細胞的不同狀態。

結果顯示，99個參數與葡萄糖代謝紊亂高度相關，51個參數與脂質代謝紊亂高度相關，131個參數與能量代謝紊亂高度相關，76個參數與氧化應激高度相關。通過整合四個病理過程中的參數，該圖譜為表征肝細胞代謝功能障礙提供了一個綜合框架。

3.4 芪桂降脂方提取物改善MASLD異常細胞模型

芪桂降脂方提取物（10–100 μg/mL）處理后未觀察到明顯細胞毒性，各測試濃度下細胞活力均保持在90%以上。隨后，本研究在10、30和100 μg/mL濃度下評估芪桂降脂方對MASLD的改善作用。結果顯示，芪桂降脂方可改善HepG2細胞的代謝功能，例如提高葡萄糖消耗和葡萄糖攝取水平。同時，芪桂降脂方減少了脂滴堆積，并降低了細胞內TC和TG水平。此外，芪桂降脂方能夠增加55 mM葡萄糖刺激下HepG2細胞中的ATP含量，并防止氧化應激損傷。

3.5 芪桂降脂方的化學成分表征

芪桂降脂方中的化學成分是其發揮藥理作用的物質基礎。為表征其非揮發性成分，本研究采用UPLC-Q-TOF MS進行分析。經優化色譜和質譜條件后，在正、負離子模式下采集MS1和MS2數據。利用MassHunter Qualitative Analysis B.10.0軟件，本研究共鑒定出117種化合物，包括57種黃酮類、11種酚類、10種蒽醌類、10種萜類、7種苯丙素類、5種氨基酸、5種有機酸、3種生物堿、2種核苷、2種糖類以及5種其他類型化合物。

圖3 芪桂降脂方的化學成分表征及藥理作用驗證。
（A）芪桂降脂方干預后HepG2細胞中2-NBDG、Bodipy、ATP Red-1和DCFH-DA的代表性熒光圖像。（B）芪桂降脂方干預后HepG2細胞的相對葡萄糖攝取水平（n=6）。（C）芪桂降脂方干預后HepG2細胞的相對脂滴堆積水平（n=6）。（D）芪桂降脂方干預后HepG2細胞中TC的相對含量（n=6）。（E）芪桂降脂方干預后HepG2細胞中TG的相對含量（n=6）。（F）芪桂降脂方干預后HepG2細胞的相對ATP含量（n=6）。（G）芪桂降脂方干預后HepG2細胞的相對ROS水平（n=6）。（H）芪桂降脂方在正、負離子模式下的總離子流圖。（I）芪桂降脂方化學成分的分類注釋。統計分析中，所有數值均以均值±標準差表示。*表示模型組與對照組之間存在統計學差異；。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；<0.05，#<0.01，##<0.001。

3.6 芪桂降脂方活性成分篩選

本研究采用自動制備液相色譜系統，以時間觸發模式對芪桂降脂方提取物進行分離。共收集到128個具有梯度極性的餾分（QGJZF 1–128），并建立了芪桂降脂方餾分庫。隨后，采用UPLC-Q-TOF MS采集各餾分的MS1數據。結果顯示，不同餾分之間分子離子峰存在明顯差異，說明該方法能夠有效分離芪桂降脂方中具有不同極性的化合物。研究從各餾分的總離子流圖中提取特征峰，并整合其峰數、保留時間（RT）、質荷比（m/z）及對應餾分信息。隨后進行峰對齊以篩選高質量特征，其中m/z匹配容差≤10 ppm，RT匹配容差≤0.3 min。僅保留至少在兩個餾分中檢測到的特征，最終生成包含22,583個特征離子的化學數據集。基于10 μg/mL的安全濃度，本研究使用128個芪桂降脂方餾分處理高糖暴露的HepG2細胞，從而構建了包含17,280張圖像及其MASLD相關參數矩陣的表型圖像數據集。

化學-表型相關性分析通過活性評分和聚類評分鑒定芪桂降脂方中的活性成分。這些評分通過將芪桂降脂方各餾分的質譜離子數據與多維表型數據相結合獲得。離子水平活性通過兩步評分流程進行評估。首先，利用遍歷算法查找所有含有該離子的餾分，并根據MASLD相關歸一化表型參數絕對值的均值為每個餾分賦予“活性評分”。隨后，通過匯總所有對應餾分的活性評分計算離子活性評分。Z分數分布超過第80百分位的離子被初步定義為活性離子。為進一步優化篩選結果，本研究利用共享同一離子的餾分之間的Pearson相關性計算“聚類評分”，以反映表型調控的一致性。聚類評分高于0.8的離子被定義為高置信度活性特征。詳細篩選流程見圖4A。

篩選結果顯示，芪桂降脂方處理組的AS Z分數分布與模型組存在明顯差異。這一現象在四個關鍵病理過程中均一致出現，包括葡萄糖代謝紊亂、脂質代謝紊亂、能量代謝紊亂和氧化應激。這些結果提示，芪桂降脂方可能有效改善上述病理表型。隨后，本研究采用CS評估候選特征離子的表型相關性。最終，分別在四個關鍵病理過程中鑒定出717、695、700和751個活性特征離子。所有篩選結果均通過穩健性評估，SSMD值均大于1。

本研究從芪桂降脂方中鑒定出作用于MASLD四個關鍵病理過程的活性成分。18種化合物，包括毛蕊異黃酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、芒柄花素等，可改善葡萄糖代謝穩態；19種化合物，包括川陳皮素、蘆丁等，可緩解脂質代謝紊亂；17種化合物，包括決明素、山柰酚-3-O-蕓香糖苷等，可恢復能量代謝平衡；16種化合物，包括檸檬酸、異美橙皮內酯等，可減輕氧化應激損傷。

圖4 芪桂降脂方活性成分篩選。
（A）基于AS和CS的兩步評分策略。（B）特征離子AS Z分數的累積分布圖（葡萄糖代謝紊亂-細胞膜）。（C）特征離子AS Z分數的累積分布圖（葡萄糖代謝紊亂-線粒體）。（D）特征離子AS Z分數的累積分布圖（葡萄糖代謝紊亂-內質網）。（E）特征離子AS Z分數的散點圖（葡萄糖代謝紊亂-細胞膜）。（F）特征離子AS Z分數的散點圖（葡萄糖代謝紊亂-線粒體）。（G）特征離子AS Z分數的散點圖（葡萄糖代謝紊亂-內質網）。（H）葡萄糖代謝紊亂相關活性特征離子的韋恩圖。（I）脂質代謝紊亂相關活性特征離子的韋恩圖。（J）能量代謝紊亂相關活性特征離子的韋恩圖。（K）氧化應激相關活性特征離子的韋恩圖。

圖5 芪桂降脂方潛在活性成分的功能注釋。

3.7 芪桂降脂方活性成分藥理作用驗證

本研究在10 μM濃度下檢測活性成分的體外藥理作用。結果顯示，這些化合物可增強高糖暴露HepG2細胞的葡萄糖消耗，減少細胞內脂滴堆積，恢復ATP水平，并清除過量ROS。

據此，本研究進一步選擇毛蕊異黃酮、決明素、4-甲基肉桂酸和6-去甲氧基橘皮素，在原代小鼠肝細胞中進行驗證。在1–20 μM濃度范圍內，這四種化合物均以劑量依賴性方式發揮上述藥理作用。

3.8 芪桂降脂方活性成分的網絡藥理學分析

基于篩選得到的全部活性成分，本研究將其潛在靶點與MASLD相關疾病靶點取交集，以探索其潛在機制。韋恩分析鑒定出與四個病理過程相關的交集靶點：葡萄糖代謝紊亂相關靶點344個，脂質代謝紊亂相關靶點338個，能量代謝紊亂相關靶點331個，氧化應激相關靶點334個。隨后，利用STRING數據庫構建各病理過程的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，并通過拓撲學分析分別鑒定出48、62、52和56個核心靶點。這些結果表明，活性成分通過協同調控這些關鍵靶點發揮作用，并在多個病理過程中產生綜合干預效應。

通路富集分析揭示了活性成分調控多個病理過程的潛在機制。在葡萄糖代謝方面，分析結果提示其涉及AGE-RAGE、胰島素和胰高血糖素信號通路。對于脂質代謝調節，這些化合物可能通過促進脂解并調控脂質代謝相關信號通路發揮治療作用。在能量穩態方面，mTOR、AMPK和FoxO信號通路被鑒定為調控細胞能量合成、利用和平衡的關鍵通路。決明素等化合物可調節活性氧代謝和HIF-1信號，從而改善氧化應激損傷。綜上，本研究鑒定了芪桂降脂方中能夠改善MASLD不同病理過程的活性成分。為更直觀地展示芪桂降脂方抗MASLD的多成分調控網絡，本研究基于活性成分信息構建了網絡。基于該調控網絡，可以高效識別活性成分調控疾病改善的作用形式。

圖6 活性成分的藥效學驗證及網絡藥理學研究。
（A）活性成分促進葡萄糖消耗的藥效學驗證（n=3）。（B）芪桂降脂方藥物靶點與葡萄糖代謝紊亂相關靶點的韋恩圖。（C，D）葡萄糖代謝紊亂核心靶點的KEGG通路富集分析。（E）芪桂降脂方抗MASLD的多成分調控網絡。統計分析中，所有數值均以均值±標準差表示。*表示模型組與對照組之間存在統計學差異；。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；<0.05，#<0.01，##<0.001。

【Citation】:Xu X, Zhou F, Wu Z, et al. Discovery of Active Compounds in Qigui Jiangzhi Formula for Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease by a Multidimensional Phenotypic Analysis.Phytochem Anal. Published online April 22,2026.

【貢獻】★★★★★

本研究通過建立一種多維表型篩選策略，解決了傳統單指標篩選方法在代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD）研究中的固有局限。該方法能夠捕捉MASLD病理過程復雜且多因素的特征，從而實現對藥物療效更全面的評估。將該策略應用于中藥復方芪桂降脂方后，本研究成功鑒定出多種生物活性成分。進一步結合網絡藥理學分析發現，這些成分可能通過同時靶向葡萄糖代謝紊亂、脂質代謝紊亂、能量代謝紊亂和氧化應激等多個病理過程來緩解MASLD。其協同作用可能通過AGE-RAGE、NAFLD、AMPK和HIF-1等關鍵信號通路介導。通過實現對多個疾病相關表型的同步評價，該多維方法克服了單指標檢測的還原論局限，并為解析中藥復方藥效物質基礎提供了一種新的系統性研究范式。

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