《Mater. Today Bio》第三軍醫大學董世武等人：水凝膠治療骨質疏松

骨質疏松癥（OP）是一種臨床常見的骨骼疾病，其破骨細胞（OCs）過度活化會顯著延緩骨再生進程。在此背景下，骨再生不僅需要促進成骨與抑制骨吸收，還對血管化（尤其是H型血管）提出了更嚴格的要求。近年來，鍶（Sr）作為"雙效骨劑"既能促進骨形成又可抑制骨吸收，卻仍未獲得足夠重視。鑒于破骨前體細胞（pOCs）分泌的PDGF-BB能在成骨耦合過程中誘導H型血管形成，Sr2+對破骨細胞生成的調控作用亟需在血管化骨再生領域深入研究與應用。

來自中國人民解放軍第三軍醫大學的董世武等團隊通過用Sr2+部分取代層狀雙氫氧化物（LDH）中的二價金屬離子，合成了鍶取代LDH（Sr-LDH），并將表面修飾的Sr-LDH封裝至含有QK肽的甲基丙烯酰化明膠（GelMA）中，形成復合水凝膠GelMA-QK/Sr-LDH@PDA（GLQ）。這種多功能水凝膠整合了Sr-LDH的促成骨與抗吸收特性，在骨質疏松條件下展現出顯著的骨再生功效。進一步研究發現，GLQ能刺激骨髓源性巨噬細胞（BMMs）增殖并維持pOCs群體，同時抑制OC成熟分化，從而促進PDGF-BB表達并推動骨缺損區H型血管發育。該多功能復合水凝膠為未來骨質疏松性骨缺損治療提供了重要臨床轉化價值。相關工作以題為“Strontium-loaded multifunctional gelatin methacryloyl hydrogels for type-H vascularized bone regeneration under osteoporotic conditions”的文章發表在2025年05月29日的期刊《Materials Today Bio》。

【材料的合成與表征】

LDH與Sr-LDH的SEM和TEM結果如圖1A、B所示，二者均呈現納米層狀結構。值得注意的是，Sr的引入并未阻礙LDH納米層狀結構的形成。通過PDA氧化自聚合對Sr-LDH進行表面修飾后，獲得的Sr-LDH@PDA經TEM觀察顯示，PDA修飾未改變Sr-LDH的晶體結構。DLS分析表明，PDA表面修飾雖使Sr-LDH納米片的尺寸略有增加，但顯著提升了其分散性。這一改進對實現水凝膠基質中的均勻分散至關重要，從而為Sr2?的長期緩釋奠定了理想基礎。本文通過EDS與ICP對LDH及Sr-LDH的元素組成進行定性與定量分析。如圖1C、D所示，EDS結果證實Sr成功摻入LDH結構并均勻分布，形成Sr-LDH。基于LDH化學組成的可調控性，本研究采用共沉淀法將Sr2?引入LDH，因其與Mg2?價態相同，故部分取代Mg2?制備出Sr-LDH。ICP定量分析顯示，Sr2?部分取代Mg2?后，Sr-LDH中Mg:Sr比例約為6:1。

不同GelMA水凝膠的SEM圖像如圖1E所示。結果表明，本研究制備的GelMA水凝膠具有大孔徑多孔結構，有利于細胞黏附與生長。這種大孔結構模擬了體內微環境，使細胞能在三維環境中生長，同時促進營養物質/調控因子的運輸、代謝產物的排泄及細胞間通訊。需特別指出的是，學界普遍認為多孔水凝膠能促進血管化及新生骨組織形成。

圖1 材料的形貌與組分表征

圖2A展示了水凝膠樣品的典型照片，所有圓柱狀水凝膠直徑約5毫米、高度約2毫米。本文系統評估了不同GelMA水凝膠的體外降解行為（4周周期）、Sr2?釋放曲線及QK肽釋放動力學（圖2B、C）。如圖2B降解曲線所示，通過AC-PEG-NHS偶聯QK肽的水凝膠較未修飾組降解更緩慢，28天后仍保留約91%初始質量；而直接摻雜Sr-LDH@PDA納米片的水凝膠降解最快，這可能是由于無機納米材料的引入破壞了水凝膠網絡結構所致。對于復合水凝膠GLQ，盡管含有Sr-LDH@PDA納米片，但因存在AC-PEG-NHS連接的QK肽，28天后仍保留約76%初始質量，表明GLQ能維持長期穩定性，有利于骨組織再生的持續緩慢進程。

圖2C(a)顯示GLQ復合水凝膠可實現Sr2?的持續緩釋。累積釋放曲線表明，GLQ組的Sr2?釋放顯著慢于GL組，這歸因于QK肽通過AC-PEG-NHS交聯至GelMA網絡，強化了水凝膠結構從而延緩降解。值得注意的是，GL與GLQ組在第10天時均呈現近平臺期釋放特征（累計釋放約20%），這種與降解進程同步的釋放模式能滿足骨質疏松條件下骨修復的長期治療需求。圖2C(b)中QK肽釋放曲線顯示，相較于直接混合QK肽的G/Q組，通過AC-PEG-NHS偶聯的GLQ組釋放更緩慢。雖然Sr-LDH@PDA納米片的加入部分破壞了水凝膠網絡導致QK釋放相對加速，但仍慢于G/Q組。這種納米片介導的加速釋放可能源于雙重機制：化學作用（納米顆粒與GelMA基質的靜電/氫鍵/共價交聯破壞網絡穩定性）與物理作用（納米顆粒提升孔隙率并重組微觀結構，促進水分滲透和降解動力學）協同導致水凝膠解體。此外，GQ與GLQ組在第10天趨于平臺期，而G/Q組仍呈加速釋放趨勢，進一步證實AC-PEG-NHS作為連接分子對QK肽緩釋的關鍵作用。該雙功能PEG交聯劑中，丙烯酸酯參與光固化GelMA水凝膠形成，NHS則與QK肽的氨基形成穩定酰胺鍵，將QK肽錨定于強化網絡中延長釋放周期。綜上，Sr2?與QK肽的雙重緩釋可延長體內有效濃度時間，減少代謝損耗，提高生物利用度并降低副作用。

圖2 GelMA水凝膠的理化性能、力學性能及生物相容性

【復合水凝膠GelMA-QK/Sr-LDH@PDA在體外實驗中顯示出抑制骨吸收、增加前破骨細胞(pOC)數量并促進PDGF-BB釋放的作用】

經過五天破骨細胞誘導培養后，骨髓單核巨噬細胞(BMMs)的TRAP染色及定量分析結果如圖3(A、E、F)所示。TRAP染色顯示，常規誘導的C組和G組BMMs成功分化融合形成多核成熟破骨細胞(OCs)，細胞面積大且邊界清晰；而GL組與GLQ組的破骨細胞融合進程顯著受抑，表現為大體積TRAP陽性細胞數量較C組明顯減少，且未出現融合的大型成熟OCs(圖3A)。TRAP陽性區域定量分析(圖3E)證實GL組與GLQ組數值顯著低于C組。值得注意的是，對TRAP染色圖像中單核pOC的計數結果顯示(圖3F)，GL組與GLQ組的pOC數量不僅未被抑制，反而顯著高于G組與C組，這表明Sr-LDH具有增加pOC數量的作用，與本研究團隊前期圖2E中發現的含鍶組GL/GLQ促進BMM增殖的結果一致。

本文通過骨吸收實驗進一步評估破骨細胞的骨吸收能力：將BMMs接種于牛骨切片與膠原板上進行7天破骨誘導培養。甲苯胺藍染色結果顯示(圖3B)，常規誘導的C組與G組骨切片表面出現多個甲苯胺藍陽性區域，并伴有明顯穿孔結構，這些光學顯微鏡下的半透明區域是骨吸收的直接證據；而GL組與GLQ組不僅陽性區域顯著減少，且未見穿孔痕跡，表明其破骨細胞骨吸收能力受到顯著抑制。此外，膠原板骨吸收實驗結果更直觀顯示GL組與GLQ組的骨吸收能力被顯著遏制(圖3C)，相應吸收區域的定量分析結果(圖3G)與上述發現趨勢一致。

圖3 GelMA-QK/Sr-LDH@PDA水凝膠在體外抑制破骨細胞生成并促進PDGF-BB釋放

【GelMA-QK/Sr-LDH@PDA水凝膠在體外顯著促進成骨作用】

對骨髓間充質干細胞(BMSCs)進行7天成骨誘導后，ALP染色及定量分析結果如圖4A、D所示。ALP染色圖像顯示，相較于C組與G組，GL組與GLQ組呈現更廣泛的ALP陽性區域且染色更深。ALP陽性區域的定量分析結果與此一致，證實GL組與GLQ組能顯著促進成骨細胞(OBs)中ALP的表達。經28天成骨誘導后，BMSCs的茜素紅S染色及定量分析結果如圖4B、E所示。代表性染色圖像顯示，與C組和G組相比，GL組與GLQ組具有更多茜素紅S陽性區域且礦化結節染色更深，定量數據進一步驗證了這兩個組別顯著增強了OBs中鈣化結節的形成。

為深入探究不同組別水凝膠上清液對BMSCs成骨分化的影響，在7天成骨誘導后提取細胞RNA并進行qRT-PCR分析(圖4G-K)。結果表明復合水凝膠GelMA-QK/Sr-LDH@PDA能顯著提升成骨相關標志基因(ALP、Runx2、Osterix、Col1、OPN)的表達水平。其中Osterix作為成骨細胞分化的關鍵轉錄因子，GL組較G組表達量顯著升高，證實Sr-LDH具有促進成骨作用；Runx2則是調控成骨細胞分化發育的重要轉錄因子，可促進骨形成、礦化及骨健康維持中不可或缺的OPN與Col1基因的轉錄翻譯。

圖4 GelMA-QK/Sr-LDH@PDA水凝膠在體外促進成骨分化

【GelMA-QK/Sr-LDH@PDA水凝膠顯著增強體外血管化能力】

通過管形成實驗評估bEnd.3細胞在不同GelMA水凝膠（G組、GL組和GLQ組）上的血管形成能力，以Matrigel組作為陽性對照（圖5A）。結果顯示，在GelMA系列水凝膠中，GLQ組最能有效促進bEnd.3細胞形成管狀結構，其環形結構數量、分支點數量及管腔直徑均接近Matrigel組水平（圖5C-E）。細胞遷移實驗表明（圖5B、F），所有GelMA水凝膠組（G、GL、GLQ）均顯著促進細胞遷移，其中GLQ組增強效果最為突出。G、GL、GLQ三組遷移率依次遞增，證實Sr-LDH與QK肽均有利于內皮細胞遷移。經7天誘導培養后，qRT-PCR檢測顯示（圖5G、H），GLQ組的CD31和vWF基因相對表達量顯著高于其他組。vWF蛋白水平反映內皮細胞活化狀態，而CD31（即血小板內皮細胞黏附分子-1）對外周血管連接/完整性調控具有重要作用。該結果證實GelMA-QK/Sr-LDH@PDA復合水凝膠較其他組更能促進血管化，此效應主要歸功于QK肽的作用，與既往研究結論一致。G組與GL組的CD31、Emcn相對表達量無顯著差異，且均顯著低于GLQ組，表明復合水凝膠中的Sr-LDH對血管化無顯著促進作用，進一步印證了VEGF模擬肽QK在增強血管化方面的卓越效能。

圖5 GelMA-QK/Sr-LDH@PDA水凝膠在體外增強血管

【GelMA-QK/Sr-LDH@PDA水凝膠顯著促進骨質疏松性骨缺損模型的體內骨再生】

通過Micro-CT掃描與三維重建進行骨再生可視化及定量分析（圖6A），術后8周取材顯示：與假手術組（Sham）相比，卵巢切除組（OVX）的骨密度（BMD）和骨體積分數（BV/TV）顯著降低（圖6C、D）。Goldner三色染色結果（圖6B）證實OVX組骨小梁明顯稀疏，結合Micro-CT結果成功建立雌激素缺乏型骨質疏松大鼠模型，為后續水凝膠治療效果評估提供臨床前研究平臺。骨缺損造模并植入材料8周后，Micro-CT分析顯示（圖6E-G）：與空白對照組（C組）相比，GLQ組的BMD和BV/TV值顯著提升，表明該復合水凝膠具有最優的骨修復效能。

圖6 GelMA-QK/Sr-LDH@PDA水凝膠促進骨質疏松性骨缺損的再生修復

Goldner染色結果（圖7A）進一步證實，GLQ組缺損區實現完全閉合且與原始皮質骨無縫整合（紅色虛線框標示），同時各組均可見水凝膠殘留，說明GelMA水凝膠的緩釋降解特性與骨再生進程良好匹配。破骨細胞TRAP免疫組化染色顯示（圖7B），GLQ組骨再生區周圍存在多核破骨細胞聚集的TRAP陽性區域（圖7C）。結合同區域Goldner染色結果，這些TRAP陽性區域恰好分布于未礦化的新生骨周圍，提示在骨再生早期階段破骨細胞尚未啟動骨吸收功能。值得注意的是，術后8周組織學觀察顯示新生骨仍處于早期礦化階段，遠未進入破骨細胞介導的骨改建期——該階段通常發生于修復期后期，涉及骨痂重塑與骨小梁結構優化。CD31免疫組化評估顯示（圖7D），GLQ組缺損區CD31陽性細胞數量最多，骨再生區域可見多個由CD31陽性細胞構成的完整血管環狀結構，環內存在類血小板細胞，證實該組血管化程度顯著優于其他各組。

圖7 GelMA-QK/Sr-LDH@PDA在骨缺損區域增加TRAP+與CD31+細胞，并伴隨更好的骨再生效果

GelMA-QK/Sr-LDH@PDA通過抑制破骨細胞成熟并保留前體破骨細胞（pOCs），促進PDGF-BB的釋放，從而增強H型內皮血管化。圖8A與C-D顯示的TRAP與PDGF-BB免疫熒光及分析表明，GLQ組使骨再生區TRAP+/PDGF-BB+細胞數量增加。結合圖7C-D組織學結果可見，骨再生區PDGF-BB高表達，根據Goldner三色染色與CD31染色結果，這些TRAP陽性區域附近還可見增強的新骨形成與血管化。值得注意的是，不同于骨再生良好區域破骨細胞數量通常減少的共識，本研究發現骨再生區TRAP表達升高伴隨更多破骨細胞，這促進了PDGF-BB表達進而加速骨再生。該結果與圖2E、圖3(F,H,I)的細胞分子實驗結果一致：含Sr2+的GL與GLQ在破骨細胞生成早期促進其增殖，并通過維持pOCs同時抑制成熟破骨細胞（OC）來增強PDGF-BB表達（ELISA與qRT-PCR結果證實）。

學界公認血管化在骨再生中起關鍵作用，其中H型血管作為特殊亞型對骨形成具有顯著調控作用，與骨量維持及穩態密切相關。圖8B、E-F的CD31/Emcn共染免疫熒光顯示，相較于對照組，所有GelMA水凝膠組的骨再生區熒光強度顯著增加，其中GLQ組平均熒光強度最高，表明復合水凝膠GLQ能促進H型血管形成。綜合共染結果與前期組織學評估可知，GLQ通過上述機制增加PDGF-BB釋放，展現出促進骨質疏松性骨再生的潛力。此外，圖8A中GLQ組合并圖像顯示再生區內殘留水凝膠邊緣與新生骨組織相互嵌合，水凝膠表面可見細胞浸潤跡象，其降解速率與骨再生進程動態匹配，表明該材料是具有臨床轉化潛力的骨修復生物材料。

圖8 GelMA-QK/Sr-LDH@PDA促進PDGF-BB釋放并增強H型內皮血管化

【總結與展望】

骨質疏松癥一直是全球性重大健康問題。盡管臨床上廣泛使用各類破骨細胞抑制劑和促骨形成藥物以重建失衡的骨代謝平衡，但這些治療手段在修復骨質疏松性骨缺損時仍難以實現充分的血管化和理想的骨再生效果。本研究設計了一種多功能復合水凝膠GelMA-QK/Sr-LDH@PDA，以甲基丙烯酰化明膠（GelMA）為載體，整合了鍶負載納米顆粒（Sr-LDH）。該復合生物材料系統統籌考慮了Sr-LDH的雙重調控作用，結合QK肽的干細胞招募功能與VEGF擬態活性，在促進成骨與血管化的同時，還能對破骨細胞生成過程進行精準調控——通過抑制破骨細胞成熟并促進保留的前體破骨細胞（pOCs）釋放PDGF-BB，進而驅動H型血管形成，最終在骨質疏松條件下實現骨再生增強。這一策略為未來骨質疏松性骨缺損的治療提供了重要臨床轉化思路。此外，本研究采用的材料設計策略（如通過層狀雙氫氧化物可調控的化學組成負載生物活性離子以靶向調節生理/病理過程，或將功能性多肽與水凝膠系統整合以啟動并維持特定生物響應）也為其他疾病領域的生物醫用材料開發提供了有價值的參考范式。

參考資料：

https://doi.org/10.1016/j.mtbio.2025.101909

來源：EngineeringForLife