免疫細(xì)胞圈門(mén)策略：去死細(xì)胞、去粘連體、圈門(mén)順序，一篇教會(huì)你

圈門(mén)就是在散點(diǎn)圖上一步步劃定你感興趣的區(qū)域，從成千上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中把目標(biāo)群體「篩」出來(lái)。但要注意，圈門(mén)策略沒(méi)有萬(wàn)能模板 —— 它完全取決于你的樣本類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

今天，小編帶大家看一下國(guó)際流式學(xué)會(huì)（ISAC）旗下的 Cytometry Part A 期刊中的 OMIP 專(zhuān)欄（Optimized Multicolor Immunofluorescence Panels），里面收錄了上百套經(jīng)過(guò)同行評(píng)議、可以直接拿來(lái)用的多色流式檢測(cè)方案。其中，OMIP-001 作為開(kāi)篇之作，教大家學(xué)會(huì)「如何系統(tǒng)分析人外周血中 T 細(xì)胞的分化狀態(tài)和功能活性」。

今天我們就以 OMIP-001 為主線，再配合一些其他有代表性的圖例，一步步拆解免疫細(xì)胞圈門(mén)的基本思路。

圖 1 源自： OMIP-001

第一步：去粘連 —— 確保每個(gè)被計(jì)數(shù)的細(xì)胞都獨(dú)立通過(guò)

在獲取血液或細(xì)胞懸液樣本時(shí)，細(xì)胞與細(xì)胞之間常常會(huì)發(fā)生粘連，形成「雙聯(lián)體」甚至「多聯(lián)體」。如果這些粘連體被當(dāng)作單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析，的計(jì)數(shù)將嚴(yán)重失準(zhǔn)，功能分析也會(huì)受到極大干擾。

圖 2 源自：優(yōu)寧維官網(wǎng)

當(dāng)你拿到一份血液或細(xì)胞懸液樣本時(shí)，細(xì)胞之間常常會(huì)粘在一起，形成「雙聯(lián)體」甚至「多聯(lián)體」。如果把這些「抱團(tuán)」的細(xì)胞當(dāng)成單個(gè)細(xì)胞來(lái)分析，細(xì)胞數(shù)量就會(huì)嚴(yán)重失真，后續(xù)的功能分析也跟著跑偏。

那么怎么把粘連體去掉呢？OMIP-001 方案在分析的第一關(guān)就做了「去粘連」處理。用 FSC-A（前向散射光脈沖面積）和 FSC-W 或 FSC-H（前向散射光脈沖寬度或高度）這兩個(gè)參數(shù)來(lái)比對(duì)。

原理其實(shí)不復(fù)雜：?jiǎn)蝹€(gè)細(xì)胞通過(guò)激光束時(shí)，信號(hào)的面積和高度大致成正比；而兩個(gè)細(xì)胞粘在一起通過(guò)時(shí)，面積會(huì)明顯變大，但高度變化不大 —— 兩者的比例就會(huì)出現(xiàn)異常。你只需要在散點(diǎn)圖上圈出「面積 ≈ 高度」那個(gè)線性區(qū)域里的細(xì)胞，就能有效排除雙聯(lián)體。此外：不同型號(hào)的流式細(xì)胞儀可能用不同的參數(shù)組合（比如 FSC-W/FSC-A 或 FSC-H/FSC-A）。如果你做細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)，用 A 和 W 的組合去粘連會(huì)更徹底。

圖 3 源自：優(yōu)寧維官網(wǎng)

第二步：排除死細(xì)胞

活細(xì)胞與死細(xì)胞之間一個(gè)關(guān)鍵的區(qū)別在于細(xì)胞膜的完整性。活細(xì)胞細(xì)胞膜完整，熒光染料無(wú)法自由進(jìn)入，染色信號(hào)清晰可控；而死細(xì)胞的細(xì)胞膜發(fā)生破損，各種抗體和染料會(huì)非特異性結(jié)合到胞內(nèi)組分上，產(chǎn)生大量虛假的陽(yáng)性信號(hào)。

圖 4 源自：小桔網(wǎng)

OMIP-001 方案中采用了胺反應(yīng)型死活染料 VIVID 來(lái)識(shí)別死細(xì)胞。活細(xì)胞的細(xì)胞膜完好，染料不能進(jìn)入，信號(hào)維持低水平；死細(xì)胞膜破損，染料自由滲入并與胞內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)結(jié)合，熒光信號(hào)陡升。研究者將 VIVID 的熒光信號(hào)繪制成直方圖，圈出低熒光區(qū)域（即活細(xì)胞區(qū)域），這樣就從源頭上將有問(wèn)題的死細(xì)胞排除在外。

OMIP-001 在排除死細(xì)胞的同時(shí)，將 CD14 和 CD19 納入同一個(gè)「排除通道」——CD14 標(biāo)記單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，CD19 標(biāo)記 B 細(xì)胞 —— 這樣在第一步去粘連之后，通過(guò)一次操作就完成了「活細(xì)胞+去除單核/B 細(xì)胞 」的雙重篩選，高效且簡(jiǎn)潔。

圖 5 源自：OMIP-001

第三步：從淋巴細(xì)胞門(mén)到 T 細(xì)胞

在活細(xì)胞群體中，不同類(lèi)型的細(xì)胞在大小（FSC）和內(nèi)部顆粒復(fù)雜度（SSC）方面差異顯著。根據(jù) FSC 和 SSC 兩個(gè)物理參數(shù)，可以初步區(qū)分淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。FSC 越高代表細(xì)胞越大，SSC 越高代表胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)（如溶酶體、分泌囊泡等）越豐富。（標(biāo)本在 FSC/SSC 散點(diǎn)圖可將淋巴細(xì)胞群（R1，紅色）、單核細(xì)胞群（R2，綠色）、粒細(xì)胞群（R3，紫色）、非白細(xì)胞群（R4，藍(lán)色）清晰地區(qū)分開(kāi)。

圖 6 源自：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血淋巴細(xì)胞亞群指南

根據(jù)淋巴細(xì)胞的發(fā)生來(lái)源、形態(tài)結(jié)構(gòu)、表面標(biāo)志物及免疫功能不同，淋巴細(xì)胞可分為 T 細(xì)胞(CD3+)、B 細(xì)胞 (CD3-CD19+) 和 NK 細(xì)胞 (CD3-CD16+CD56+) 等細(xì)胞群，此外，根據(jù) CD4 和 CD8 的表達(dá)不同，T 細(xì)胞又分為 2 個(gè)亞群：輔助性 T 細(xì)胞 (CD3+CD4+) 和殺傷性 T 細(xì)胞 (CD3+CD8+)。

圖 7 源自：知乎網(wǎng)

如果你在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中希望同時(shí)分析淋巴細(xì)胞中所有的免疫細(xì)胞亞群，可以從淋巴細(xì)胞門(mén)先分 CD3+T 細(xì)胞。而也有先圈出 CD45+的總白細(xì)胞，再逐步分選 T 細(xì)胞、B 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等各類(lèi)免疫細(xì)胞亞群，從而構(gòu)建一個(gè)完整的全白細(xì)胞圖譜。總之不同方案服務(wù)于不同的研究目標(biāo)，圈門(mén)邏輯也隨之調(diào)整。

圖 8 源自：https://www.iivd.net/thread-79634-1-1.html

第四步：功能評(píng)估與記憶/分化亞群分析

OMIP-001 之所以被稱(chēng)為 OMIP 系列的「開(kāi)篇經(jīng)典」，是因?yàn)樗恢煌Ａ粼?T 細(xì)胞的「身份鑒定」，在確定了 CD4+和 CD8+T 細(xì)胞后，還進(jìn)一步回答了「這些 T 細(xì)胞到底能干什么」這個(gè)深層問(wèn)題 ——也就是「功能性免疫學(xué)」的核心命題。

圖 9 源自：優(yōu)寧維官網(wǎng)

（1）功能評(píng)估：在確定了 CD4+和 CD8+T 細(xì)胞后，進(jìn)一步檢測(cè)三種關(guān)鍵細(xì)胞因子的分泌情況：如 IFN-γ（干擾素-γ，反映 T 細(xì)胞的殺傷性潛能）、TNF-α（腫瘤壞死因子-α，反映炎癥效應(yīng)能力）和 IL-X（白介素-X，反映 T 細(xì)胞的增殖和分化）。

圖 10 源自：小桔網(wǎng)

OMIP-001 的策略是：利用 FlowJo 軟件中的 Boolean gate（布爾邏輯門(mén)）功能，將所有分泌任意一種細(xì)胞因子的 T 細(xì)胞定義為「功能性陽(yáng)性群體」（cyt+），獲得一個(gè)針對(duì)「T 細(xì)胞真實(shí)功能」的總體畫(huà)像。這種「表型+功能」的雙層分析邏輯 ——先整體評(píng)估 CD4+和 CD8+ T 細(xì)胞的因子分泌能力，再綜合評(píng)估各個(gè)亞群的功能狀態(tài)。

圖 11 源自：OMIP-001

（2）記憶與分化：將功能性陽(yáng)性細(xì)胞映射回表面標(biāo)志物的表達(dá)組合后，下一步需要確認(rèn)：這些能分泌細(xì)胞因子的 T 細(xì)胞，到底處于分化路途上的哪個(gè)階段？

OMIP-001 采用 CD45RO 和 CCR7 的組合，將 CD4+和 CD8+ T 細(xì)胞進(jìn)一步區(qū)分為：初始 T 細(xì)胞（CD45RO-CCR7+）、中央記憶 T 細(xì)胞（CD45RO+CCR7+）、效應(yīng)記憶 T 細(xì)胞（CD45RO+CCR7-）以及終末分化效應(yīng)記憶 T 細(xì)胞（TEMRA，CD45RO-CCR7-）。同時(shí)，方案中還整合了 CD27、CD57、PD-1 等標(biāo)志物，用以辨別記憶細(xì)胞是否保留共刺激/增殖潛能（CD27+），是否存在衰老/耗竭狀態(tài)（CD57+PD-1^low / PD-1^high），以及是否仍保有長(zhǎng)期存活與再激活能力（CD127/CD28）。

CD45RA/CCR7 四象限分型已經(jīng)成為 T 細(xì)胞分化免疫學(xué)評(píng)價(jià)領(lǐng)域的基本工具。

圖 12 源自：OMIP-001

最后提供一個(gè)實(shí)例應(yīng)用：小鼠全血白細(xì)胞分化全套設(shè)門(mén)方案

如果你不滿(mǎn)足于僅僅分析 T 細(xì)胞，而是希望全面分析小鼠血液中的全部白細(xì)胞亞群，那么 2024 年發(fā)表在 Cells 期刊上的一篇研究可以為你提供一個(gè)完整的技術(shù)模板。該研究由德國(guó)的 Elise Arlt 等人主導(dǎo)，在 C57BL/6J 小鼠中建立了一套從樣本處理、抗體染色到全套圈門(mén)策略的標(biāo)準(zhǔn)化方法。（文章提供了免疫細(xì)胞中多種亞群的圈門(mén)策略，具體可以參考文獻(xiàn)中的圖例）

其圈門(mén)流程分為以下關(guān)鍵步驟：

第一步：排除碎片：利用 FSC 和 SSC 散點(diǎn)圖，將紅細(xì)胞、血小板和細(xì)胞碎片排除在外（這類(lèi)組分通常聚集在左下角）；

第二步：排除死細(xì)胞：采用碘化丙啶（PI）標(biāo)記并排除死細(xì)胞；

第三步：圈出白細(xì)胞：利用 CD45 這一白細(xì)胞泛標(biāo)志物，篩選出 CD45+的完整白細(xì)胞群體；

第四步：各亞群分型：在上述 CD45+白細(xì)胞的基礎(chǔ)上，利用各種特異標(biāo)志物進(jìn)一步圈出 T 細(xì)胞（CD3+）、B 細(xì)胞（CD19+）、NK 細(xì)胞（NK1.1+）、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞及肥大細(xì)胞等多種細(xì)胞亞群，并成功完成了老齡/幼齡以及雄/雌小鼠的白細(xì)胞分化計(jì)數(shù)比較。

圖 14 PMID: 39329764

此外，該研究在去死細(xì)胞和去粘連之前，還額外增加了「去雙聯(lián)體」步驟—— 先用 FSC-A/FSC-H 兩個(gè)參數(shù)排除雙聯(lián)體和多聯(lián)體，再用 SSC-W/SSC-H 進(jìn)一步排除黏連事件，從而最大限度地確保了數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。

需要注意的是，圈門(mén)策略并沒(méi)有一個(gè)「萬(wàn)能模板」。采用哪種策略，完全取決于你的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣本性質(zhì)以及你打算回答何種科學(xué)問(wèn)題。

圈門(mén)遇到拿不準(zhǔn)的？可以進(jìn)群和學(xué)霸菌一起討論，識(shí)別下方圖片，回復(fù)「流式」，進(jìn)來(lái)一起「云實(shí)驗(yàn)」！

編輯：冷漠小 z

題圖：自制