《食品科學》：北京農學院金君華教授等：長雙歧桿菌BBMN68中應答調節蛋白BBMN68_47的自調控及metK基因調控功能

在乳酸菌（LAB）菌群中，雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）是一類革蘭氏陽性、厭氧、無鞭毛的放線菌，作為人體腸道中重要的共生微生物，其益生功能已被廣泛報道，包括抗菌和免疫調節作用。然而，絕大多數雙歧桿菌菌株的最適生長pH值為6.5～7.0，對酸性環境（如pH＜4.0）耐受性較差。在發酵過程或胃腸道環境中，酸（如乳酸/乙酸）積累常導致其存活率低于有效閾值（106～108 CFU/mL），這種酸敏感性限制了其在工業與臨床中的應用。因此，解析雙歧桿菌的酸耐受機制對于開發高存活率的工程菌株、拓展其應用前景具有重要意義。

雙歧桿菌的酸耐受機制涉及多層次的適應性響應，主要包括增強H + -ATP酶活性以維持胞內pH值穩態、上調氨基酸代謝產氨（NH 3 ）中和過量H + 、改變膜脂組成降低膜通透性及H + 內流、激活DNA及蛋白質修復系統應對酸損傷、合成胞外多糖促進生物膜形成提供物理屏障以及積累胞內抗氧化物質增強抗氧化能力。這些機制共同構成了雙歧桿菌的整合性應激響應網絡，幫助其在酸性環境中存活。

雙組分調控系統（TCS）是細菌感知環境脅迫（如酸、滲透壓、抗生素等）并進行轉錄調控的核心機制。典型的TCS由組氨酸激酶（HPK）和應答調節蛋白（RR）組成，其中RR通常具有DNA結合結構域，可調控下游基因表達。在細菌應對各種應激過程中，TCS介導的調控普遍存在。例如，SenX3-RegX3雙組分系統在分枝桿菌屬（Mycobacterium）和雙歧桿菌屬中高度保守，在磷限制條件下調控磷攝取相關基因的表達，在長雙歧桿菌BBMN68（Bifidobacterium longum subsp. longum BBMN68）中，該系統通過激活pstS基因的表達，提高ATP的累積量，從而增強細菌對膽鹽的耐受性。在長雙歧桿菌BBMN68基因組中鑒定出4 個OmpR家族的TCS：BBMN68_71/72（滲透壓響應）、BBMN68_440/441（鉀離子轉運）、BBMN68_1079/1080（磷酸鹽饑餓響應/SenX3-RegX3）；而BBMN68_47/48尚未明確歸類，缺乏同源物報道，表明其在應激適應中可能具有潛在的新穎性。

除了上述已知功能的TCS，本研究關注的BBMN68_47/48系統在前期酸適應轉錄組中表現出顯著上調，提示其可能在酸耐受響應（ATR）中扮演關鍵角色。前期研究表明，亞致死性酸適應（pH 4.5）能顯著增強長雙歧桿菌BBMN68的ATR；轉錄組分析揭示ATR涉及550多個差異表達基因，其中編碼雙組分系統的基因對BBMN68_47/48和BBMN68_1079/1080（SenX3-RegX3）均顯著上調。值得注意的是，BBMN68_47/48不僅基因表達量——RPKM上調幅度最大（RPKM值提升4 倍以上），其基礎表達水平也遠高于BBMN68_1079/1080，強烈提示其在ATR中扮演關鍵角色。然而，該系統的DNA結合特異性、調控靶基因及其對酸脅迫存活的具體貢獻尚不明確，阻礙了其在實際應用中的開發。

北京農學院食品科學與工程學院的 陳書宜、宋靜頤 和 金君華* 等人旨在闡明BBMN68_47/48系統在長雙歧桿菌BBMN68的ATR中的調控機制。通過構建3×FLAGBBMN68_47過表達菌株，結合染色質免疫共沉淀測序（ChIP-seq）全基因組鑒定結合位點、電泳遷移率變動分析（EMSA）驗證保守基序及整合轉錄組數據，系統解析BBMN68_47通過自調控及調控metK等靶基因在ATR中的核心作用，旨在為理解雙歧桿菌酸適應分子機制提供新見解，也為開發高胃酸存活率的益生菌工程菌株奠定理論基礎。

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BBMN68_47表達質粒的分子克隆與構建

以長雙歧桿菌BBMN68基因組為模板，采用含同源臂的引物PCR擴增BBMN68_47基因片段。瓊脂糖凝膠電泳分析顯示約750 bp的清晰條帶（圖1A），與預期大小（776 bp）一致。

通過NsiI/SbfI雙酶切線性化質粒pDP152（圖1B，4 453 bp），經純化后利用無縫克隆技術將NsiIBBMN68_47-SbfI插入片段連接至線性化載體（圖1C）。對轉化大腸桿菌HST08的克隆進行菌落PCR篩選，證實目標基因成功插入（圖1D）。測序驗證表明克隆片段與BBMN68_47參考序列一致性達100%，最終成功構建pDP152-BBMN68_47重組質粒。

為實現表位標簽蛋白檢測，采用分步克隆策略將3×FLAG序列插入pDP152-BBMN68_47質粒。分別擴增SmaI-3×FLAG-NsiI（107 bp）與SmaI-3×FLAG-SbfI（111 bp）片段（圖2A），并將其連接至經SmaI/NsiI線性化的pDP152-BBMN68_47及SmaI/SbfI線性化的pDP152載體（圖2B）。對壯觀霉素抗性大腸桿菌轉化子進行菌落PCR，擴增產物（300～400 bp）符合3×FLAG整合的預期大小。DNA測序證實3×FLAG標簽精準插入指定酶切位點。經質粒電泳驗證（圖2C）及后續雙歧桿菌電穿孔轉化，確認pDP152-3×FLAG與pDP152-3×FLAG-BBMN68_47質粒結構完整性，為下游蛋白表達研究奠定基礎。

在pDP152-3×FLAG-BBMN68_47重組質粒構建中，采用“先插入基因，后插3×FLAG標簽”的分步插入策略，旨在確保pDP152-3×FLAG與pDP152-3×FLAGBBMN68_47在pDP152骨架上的酶切位點均保持為SmaI/SbfI，同時保證質粒系統與下游雙歧桿菌轉化方案的兼容性（圖3）。

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重組菌株構建和分子驗證

采用電穿孔法將重組質粒pDP152-3×FLAG與pDP152-3×FLAG-BBMN68_47導入長雙歧桿菌BBMN68。鑒于該革蘭氏陽性菌具有典型厚肽聚糖層結構，常規菌落PCR驗證在技術層面不可行。因此通過活化陽性克隆培養物提取質粒進行轉化子篩選。陽性克隆質粒提取物的瓊脂糖凝膠電泳分析顯示兩條清晰條帶（圖4A）：10 000 bp處為長雙歧桿菌BBMN68基因組DNA，2 500 bp處為超螺旋質粒DNA。采用引物pDP152-F/pDP152-R進行PCR擴增，pDP152-3×FLAG獲得約500 bp產物，pDP152-3×FLAG-BBMN68_47獲得約1 500 bp產物（圖4B），該結果與重組質粒理論大小（分別為4 492 bp與5 227 bp）相符。上述證據證實成功構建工程菌株，命名為68-3×FLAG與68-3×FLAG-47。

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融合蛋白驗證、純化和功能完整性

采用酸適應表達策略誘導長雙歧桿菌工程菌株68-3×FLAG與68-3×FLAG-47表達3×FLAG標簽融合蛋白。WB分析證實工程菌株中3×FLAG標簽蛋白成功表達（圖5A）。理論計算表明3×FLAG表位標簽（24 個氨基酸）分子質量為2.7 kDa，該值低于常規SDS-PAGE系統的分辨率極限（圖5A泳道2）。然而，3×FLAG-BBMN68_47融合蛋白的WB顯示清晰條帶（圖5A泳道1），其大小與嵌合蛋白理論分子質量（3×FLAG標簽+BBMN68_47）相符。該結果證實FLAG表位在融合背景下成功翻譯，并且3×FLAG-BBMN68_47蛋白在長雙歧桿菌BBMN68中有效過表達。值得注意的是，野生型菌株蛋白質組未檢測到免疫反應條帶（圖5A泳道3），表明單克隆ANTI-FLAG M2抗體與內源細菌蛋白無可檢測交叉反應。

利用抗FLAG偶聯磁珠對菌株68-3×FLAG-47表達的3×FLAG-BBMN68_47蛋白進行親和純化，并通過過量FLAG肽競爭性洗脫。SDS-PAGE分析顯示純化后在35 kDa處出現單一條帶（圖5B泳道2），與預測分子質量一致。使用Qubit熒光定量儀測定蛋白濃度，最終純化產物質量濃度為0.45 mg/mL。

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染色質片段化和ChIP效率的驗證

對長雙歧桿菌工程菌株68-3×FLAG-47與68-3×FLAG經甲醛交聯的染色質進行超聲破碎處理，瓊脂糖凝膠電泳分析顯示DNA片段呈100～750 bp彌散性分布（圖6），主帶集中在300 bp處，證實獲得適用于下游免疫沉淀的理想片段化效果。該片段大小分布符合ChIP技術最佳區間范圍（300～500 bp），可最大限度避免剪切偏好性，確保抗體與靶DNA高效互作。溴化乙錠強染色信號證實DNA濃度高，進一步表明染色質得率滿足下游實驗需求。

通過WB檢測攜帶3×FLAG標簽的雙歧桿菌菌株經ChIP分離的染色質-蛋白質復合物。如圖7A所示，ChIP上清液（泳道1）出現微弱的重鏈信號（約55 kDa），源于磁珠殘留的一抗。Input對照組（泳道2）未檢出條帶，證實無非特異性互作。值得注意的是，ChIP洗脫液（泳道3）與IgG陰性對照（泳道4）均顯示免疫球蛋白重鏈（約55 kDa）和輕鏈（約25 kDa）條帶，此現象源于二抗與磁珠結合一抗的交叉反應。因使用不同來源抗體，兩組樣本重/輕鏈分子質量存在差異，導致WB條帶位置不一致。泳道間差異遷移率反映抗體群體的固有異質性。關鍵的是，3×FLAG表位（理論分子質量3 kDa）未檢出，這與常規SDS-PAGE系統對＜10 kDa多肽的檢測局限相符。

圖7B展示了68-3×FLAG-47菌株的WB結果。該菌株ChIP上清液（泳道1）呈現3 條清晰條帶：免疫球蛋白重鏈（55 kDa）、輕鏈（25 kDa）及顯著條帶（35 kDa），后者對應3×FLAG-BBMN68_47融合蛋白，證實ChIP處理期間重組蛋白活性表達。Input樣本（泳道2）顯示強靶蛋白信號，而ChIP洗脫液（泳道3）條帶強度進一步增強，表明染色質富集成功。IgG陰性對照（泳道4）雖保留重/輕鏈信號，但缺失3×FLAG-BBMN68_47融合蛋白條帶，證實抗體對FLAG表位的特異性識別。上述結果確證通過ChIP技術成功分離3×FLAG-BBMN68_47的染色質復合物。

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ChIP的DNA得率與特異性評估

使用FLAG標簽磁珠或IgG偶聯磁珠對ChIP樣本（68-3×FLAG與68-3×FLAG-47組）進行解交聯及DNA純化后，通過Qubit定量核酸得率（表4），以驗證ChIP得到的DNA是否滿足測序文庫構建閾值。該質控步驟對評估BBMN68_47富集效率至關重要。

68-3×FLAG組中Input樣本DNA量滿足建庫要求，但ChIP組的DNA得率不滿足建庫標準（總量＜1 ng），提示3×FLAG標簽蛋白可能不具備顯著DNA結合活性或實驗條件下結合效率低下。值得注意的是，IgG對照組DNA水平未檢出，確證抗體特異性及實驗有效性。綜合本組情況，即3×FLAG標簽蛋白對ChIP過程無影響，決定不進行后續測序及生物信息分析步驟。

與之相反，68-3×FLAG-47組Input樣本DNA得量達3 830 ng，滿足測序建庫要求。ChIP組的DNA產量達15.68 ng，顯著超過建庫最低閾值（＞1 ng）。尤為關鍵的是，IgG對照組未檢出可量化DNA（＜0.1 ng），確證檢測特異性并排除非特異性結合干擾。該結果驗證了68-3×FLAG-47組中蛋白質-DNA復合物的有效富集。基于此，該組樣本進入下游測序分析流程，旨在解析BBMN68_47蛋白結合的基因組位點。

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文庫完整性及片段分布分析

對68-3×FLAG-47組的6 個DNA文庫（圖8）進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示所有樣本均呈現均一的片段分布（250～750 bp），未檢出拖尾現象或高分子質量聚集。該電泳圖譜確證文庫構建成功——非特異性片段或擴增不完全產物通常呈現異常條帶模式。ChIP與Input文庫間電泳結果的高度一致性，充分證明實驗流程的穩健性。因此，所有文庫均通過質控并進入Illumina測序流程，以定位BBMN68_47蛋白結合的基因組位點。

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序列比對與峰識別分析

Illumina平臺測序后，6 組DNA文庫（68-3×FLAG-47 Input組與68-3×FLAG-47 ChIP組；每組3 個生物學重復）的原始數據經嚴格質控過濾獲得高質量讀段。采用優化比對參數將讀段映射至長雙歧桿菌BBMN68參考基因組。關鍵數據顯示，所有文庫共獲得156 730 244 條高質量讀段（表5），基因組總映射率達93.21%～96.72%。唯一映射率（91.24%～94.54%）變異度極低，表明比對過程具有高特異性與可重復性。

基于MACS2的narrowPeak模式進行峰識別，在排除文庫構建與測序偏好性導致的技術變異后，鑒定出118 個高置信度結合峰。這些峰主要富集于TSS（81.25%），次要分布于TTS（14.58%）及蛋白質編碼區CDS（4.17%）（圖9A）。這種以TSS為核心的分布模式強烈提示BBMN68_47在酸性脅迫條件下主要調控轉錄起始過程。

結合圖9B進一步分析標簽蛋白3×FLAGBBMN68_47在TSS處歸一化處理后測序深度的分布，明顯發現ChIP組與Input組存在顯著差異。Input文庫在TSS位點呈現特征性缺失，并伴隨微弱的下游富集峰。與之相反，ChIP文庫在TSS位點顯示顯著富集，說明ATR中BBMN68_47調節蛋白與TSS有很強的結合可能調節轉錄。上述空間分布與定量差異共同證明：在酸性脅迫條件下，BBMN68_47選擇性結合TSS區域以調控轉錄進程。

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基于HOMER的基因組峰圖分析進行從頭基序發現與功能注釋

通過HOMER軟件對118 個ChIP-seq峰（映射至97 個蛋白質編碼基因）進行基序分析，鑒定出17 個統計學顯著DNA基序（P＜0.01）。其中5 個基序與HOMER參考數據庫已知調控序列匹配（表6），值得注意的是，12 個基序與已報道序列無同源性（表7），提示BBMN68_47在酸性脅迫條件下可能存在新的DNA結合偏好性。

所有5 個已知基序（表6）在ChIP-seq峰中均顯示顯著富集（P≤0.01）。比較分析表明，這些基序在峰區的出現頻率顯著高于背景序列，所有基序富集倍數均大于3.0。該結果強有力支持這些基序與BBMN68_47結合基因組區域的非隨機關聯，但其調控功能需進一步實驗驗證。

HOMER算法鑒定的12 個從頭基序（表7）屬全新發現（現有文獻鮮見報道）。經統計驗證，前兩個基序未檢出假陽性信號，其余10 個基序存在潛在假陽性風險。盡管如此，綜合富集分析顯示所有新基序在峰序列中的富集程度是背景序列中的3 倍以上，尤以前兩個基序的富集程度最為突出（分別達13.5 倍和4.8 倍，P＜0.001）。如此顯著的富集模式表明，即使表7中部分基序存在假陽性可能，仍具潛在生物學功能意義。

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ATR調控基因的基序定位分析

將7 個候選基序（表6全部條目及表7前兩位非假陽性基序）定位至測序峰區，并與酸適應條件下的轉錄組數據進行交叉驗證。該整合分析鑒定出31 個潛在參與酸脅迫適應的關聯基因（表8）。值得注意的是，特異性轉錄調控因子BBMN68_47在長雙歧桿菌BBMN68基因組中結合于TSS及TTS。這些互作關系與靶基因轉錄激活或抑制顯著相關，其調控效應體現為酸性脅迫下差異化的RPKM值。

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靶基因驗證

為驗證ChIP-seq技術鑒定的候選靶基因，采用EMSA技術確證調控蛋白BBMN68_47對預測DNA基序的直接結合能力。盡管ChIP-seq可在生理條件下繪制全基因組結合譜，其計算預測結果因固有假陽性信號需經實驗驗證。

基于118 個ChIP來源峰，生物信息學分析鑒定出63 個保守基序，對應7 種預測結合模式（表6、7）。將這些基序與酸適應培養物的轉錄組數據集交叉比對，篩選出31 個在脅迫條件下呈現顯著RPKM值變化的基因（表8）。合成覆蓋上述基序的13 個代表性DNA探針進行EMSA驗證。經體外結合體系、非變形凝膠電泳、轉膜、紫外交聯和顯色等步驟后，探針0235與0075證實與BBMN68_47存在特異性結合（圖10、11）。

EMSA實驗證實重組3×FLAG-BBMN68_47融合蛋白與含推定調控基序（CTGGACGTTT）的0235探針發生序列特異性結合。如圖10所示（泳道3），蛋白-DNA復合物形成導致探針遷移顯著阻滯，而加入物質的量200 倍的過量未標記0235探針競爭后阻滯效應消失（泳道2）。關鍵的是，等濃度游離FLAG肽段未觀測到結合信號（泳道4～5），確證該互作由BBMN68_47介導而非表位標簽所致。這些數據確立BBMN68_47為順式作用轉錄調控因子，其選擇性識別自身啟動子區域，提示長雙歧桿菌BBMN68在ATR中通過該自調控機制調節其表達。

EMSA分析顯示3×FLAG-BBMN68_47融合蛋白與含推定metK調控基序（CTGGACGAATCCTG）的0075探針存在序列特異性結合。如圖11所示（泳道3），蛋白-DNA復合物形成引發探針遷移明顯阻滯，該效應可被物質的量200 倍過量未標記0075探針競爭性消除（泳道2）。相反，等物質的量FLAG肽段未檢測到結合（泳道4、5），證實互作由BBMN68_47特異性介導。該結果證明BBMN68_47選擇性結合metK啟動子區，支持其作為順式作用轉錄激活因子的功能，即在酸適應條件下增強長雙歧桿菌BBMN68中metK基因的表達。

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11.1 BBMN68_47作為ATR核心調控因子的確認

本研究明確了BBMN68_47是長雙歧桿菌BBMN68的ATR關鍵轉錄調節因子。利用ChIP-seq和EMSA的聯合方法揭示，在酸脅迫下，BBMN68_47直接結合到基因組的TSS上。這種結合協調下游酸反應基因的表達，并涉及在酸適應過程中放大BBMN68_47自身表達的自調節機制。類似機制在益生菌研究中已有報道。例如，對長雙歧桿菌BBMN68的研究已經探索了涉及H+-ATP酶、氨基酸代謝和肽聚糖合成的更廣泛的ATR機制。類似地，其他研究也揭示了不同雙歧桿菌菌株中存在多種參與酸耐受的機制（如胞外多糖合成、特定氨基酸代謝途徑）。

11.2 雙歧桿菌應激適應中保守調控基序的進化和功能意義

通過ChIP-seq技術發現了長雙歧桿菌BBMN68中對酸響應的DNA基序，揭示了原核生物轉錄調控與真核生物發育途徑之間意想不到的相似性。通過HOMER軟件分析，識別出5 個序列元素——FOXM1、CArG、NRF、Rbpj1和HOXA9（表9），這些元素在人類和哺乳動物系統中已有研究，但在長雙歧桿菌中鮮被報道。這一發現促使筆者重新評估不同進化域之間的調控保守性。

BBMN68_47識別的兩條基序（CTGGGCGTTT、CTGGACGAATCCTG）被轉錄調控因子BBMN68_47識別，位于靠近TSS的啟動子區域。這些基序在多種耐酸雙歧桿菌菌株中都保守，這表明在這個功能群中存在共同的調控機制。這一觀察結果與更廣泛的全基因組分析相一致，表明雖然許多核心壓力反應基因（如編碼F 1 F 0 -ATP酶和聚磷酸激酶1（PPK1）的基因）在整個雙歧桿菌屬中非常普遍，但它們的上游調控回路往往多樣化，只在特定的系統發育類群中保守，而不是普遍保守的。這種調節差異導致了在應激穩健性中觀察到的顯著的菌株特異性差異，并被認為代表了不同的適應性進化途徑，這些途徑塑造了雙歧桿菌在各種生態位（包括宿主腸道）中的生存策略。

11.3 自反饋調控：BBMN68_47的核心作用及其在ATR中的普遍意義與代謝關聯

棲息于動態且嚴酷環境（如胃腸道，面臨pH值波動、氧化應激、營養限制）的細菌，其生存依賴于能夠迅速啟動并放大的應激響應機制。自反饋調控（即調控因子直接影響自身表達）是一種高度優化的策略。它允許信號快速自我放大，實現基因表達的急劇上調，從而在瞬時或急劇變化的不利條件下（如遭遇強胃酸）提供強大的魯棒性，這對快速決定性的細胞生存反應至關重要。這種自反饋機制在生命體中普遍存在，廣泛參與原核與真核生物的應激適應和發育過程。例如，在變形鏈球菌中，BrpA通過自調控在酸和氧化應激耐受中發揮關鍵作用。同樣，根癌農桿菌的氧化還原感應因子OxyR通過結合自身啟動子精細調控其表達以響應過氧化物脅迫。在長雙歧桿菌BBMN68中，證實轉錄調節因子BBMN68_47正是通過這種高效的自反饋機制發揮作用。具體而言，BBMN68_47能夠直接結合其自身基因的啟動子區域（通過ChIP-seq和EMSA驗證），建立一個直接的正反饋調控回路。該自放大機制使得在酸脅迫信號觸發時，BBMN68_47的表達水平能夠被迅速、顯著地提升。這種自我強化的表達上調，繼而驅動其下游靶標的表達增強。這一高效的級聯放大過程，正是長雙歧桿菌BBMN68能夠實現快速有效適應酸沖擊環境并顯著提升整體酸耐受能力的關鍵分子基礎。

近年來的組學研究深化了對雙歧桿菌應激調控網絡的理解，進一步凸顯了包括自反饋在內的快速調控機制的重要性。全基因組分析表明，盡管許多核心的酸耐受機制（如維持pH值穩態的F 1 F 0 -ATP酶、作為能量儲備的PPK1）在雙歧桿菌屬中高度保守，但控制這些機制的上游調控回路（包括特定的轉錄因子及其自反饋能力）往往呈現顯著的菌株或物種特異性。這種調控元件的多樣性（例如，不同菌株中推測的應激響應轉錄因子如WhiB樣蛋白或RpoE的普遍性差異）以及特定酸中和途徑（如谷氨酸脫羧酶GadB/C途徑或天冬酰胺酶途徑）的分布差異，共同解釋了不同雙歧桿菌菌株間觀察到的應激耐受表型異質性。BBMN68_47及其自反饋回路正是這種菌株特異性高效適應策略在長雙歧桿菌BBMN68中的一個典范，使其能在特定生態位（如宿主腸道）中成功定植。

深入分析BBMN68_47的結合位點發現，其識別的特征基序不僅存在于自身啟動子，也存在于關鍵代謝基因metK（BBMN68_RS00075，編碼S-腺苷甲硫氨酸合成酶MetK）的上游調控區域。轉錄組數據顯示，在經歷酸適應的長雙歧桿菌BBMN68中，metK基因的表達水平顯著上調了2.84 倍。MetK催化生成S-腺苷甲硫氨酸（SAM），而SAM是細菌中至關重要的多功能代謝物（核心甲基供體）。已有研究明確表明，MetK/SAM在多種細菌的應激適應中扮演關鍵角色：在長雙歧桿菌中，MetK與酸耐受性相關；在大腸桿菌中，異源過表達MetK能顯著提高菌株在高滲脅迫下的存活率。上述發現強烈提示，BBMN68_47可能通過直接調控metK的表達，影響細胞內SAM的水平。SAM作為核心代謝樞紐，參與眾多對脅迫適應至關重要的過程，包括但不限于：1）甲基化反應：影響蛋白質功能、DNA修復及RNA穩定性；2）多胺合成：多胺在維持pH值穩態和抗氧化中起作用；3）群體感應信號前體：SAM是自誘導劑2（autoinducer-2，AI-2）的前體分子，AI-2介導的群體感應可協調群體行為（如生物膜形成），這對在脅迫環境中生存有利；4）氨基酸代謝中間體：SAM代謝產生同型半胱氨酸（HCY），HCY可進入半胱氨酸代謝途徑，中和細胞內的質子，在酸性條件下保護細胞的完整性（圖12）。

因此，BBMN68_47驅動的自反饋回路不僅直接放大自身及下游應激基因的表達，還可能通過上調metK，影響SAM這一核心代謝物，進而潛在調控多條與酸應激適應相關的代謝通路（如甲基化保護、群體感應協調、氨基酸代謝流調整）。這為理解轉錄調控如何整合代謝重塑以適應酸脅迫提供了重要線索。然而，BBMN68_47對metK的確切調控作用及其下游代謝網絡（如特定甲基化靶標、AI-2信號強度、HCY通量）在BBMN68酸適應中的具體貢獻，仍需通過未來的遺傳學（如構建metK突變株）和代謝組學等深入研究來精確闡明。

本研究聚焦于弱酸（pH 4.5）條件下BBMN68_47的調控網絡解析，但尚未涵蓋強酸（pH 3～2）、膽汁/高滲等復合胃腸道脅迫，且缺乏BBMN68_47敲除/突變株的功能表型驗證。未來亟需：1）在模擬胃腸道的多重脅迫下（強酸+膽汁/高滲）進行多組學（ChIP-seq、轉錄組、蛋白組）分析，構建更真實的調控網絡；2）利用CRISPR-Cas等技術構建BBMN68_47功能缺失株及關鍵點突變株，結合存活率、膜完整性及靶向代謝組學（聚焦SAM通路及膜脂代謝），系統驗證其在ATR中的因果作用及代謝重塑影響。這些深入驗證將助力開發基于BBMN68_47響應元件的“酸誘導表達系統”，用于工程化益生菌株，顯著提升其在胃酸環境及發酵生產中的存活率與應用效能。

引文格式：

陳書宜, 宋靜頤, 宋曉東, 等. 長雙歧桿菌BBMN68中應答調節蛋白BBMN68_47的自調控及metK基因調控功能[J]. 食品科學, 2026, 47(1): 142-155. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250620-150.

CHEN Shuyi, SONG Jingyi, SONG Xiaodong, et al. Autoregulation of response regulator BBMN68_47 and its regulatory function on S-adenosylmethionine synthetase (metK) gene in Bifidobacterium logum BBMN68[J]. Food Science, 2026, 47(1): 142-155. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250620-150.

實習編輯：楊倩；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網

為系統提升我國食品營養與安全的科技創新策源能力，加速科技成果向現實生產力轉化，推動食品產業向綠色化、智能化、高端化轉型升級，由北京食品科學研究院、中國食品雜志社《食品科學》雜志（EI收錄）、中國食品雜志社《Food Science and Human Wellness》雜志（SCI收錄）、中國食品雜志社《Journal of Future Foods》雜志（ESCI收錄）主辦，合肥工業大學、安徽農業大學、安徽省食品行業協會、安徽大學、合肥大學、合肥師范學院、北京工商大學、中國科技大學附屬第一醫院臨床營養科、安徽糧食工程職業學院、安徽省農科院農產品加工研究所、安徽科技學院、皖西學院、黃山學院、滁州學院、蚌埠學院共同主辦的“ 第六屆食品科學與人類健康國際研討會 ”，將于 2026年8月15-16日（8月14日全天報到） 在 中國 安徽 合肥 召開。

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