《自然·通訊》具有大分子致動器的3D水凝膠平臺，用于精確控制癌癥細胞遷移的機械力！

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摘要

機械力在調(diào)節(jié)癌癥細胞行為中起著關(guān)鍵作用，尤其是在轉(zhuǎn)移過程中。在這里，我們提出了一種三維水凝膠平臺，該平臺嵌入了近炎癥響應性大分子致動器，能夠精確機械刺激癌癥細胞中的特定整合素亞型。通過利用該系統(tǒng)，我們研究了不同的力參數(shù)——大小、頻率和持續(xù)時間——如何影響卵巢癌癥細胞球體的遷移和侵襲，重點研究了整合素αvβ3和αvβ6。我們發(fā)現(xiàn)，機械刺激在早期會增強集體侵襲，并在后期遷移過程中引發(fā)間充質(zhì)到變形蟲的轉(zhuǎn)變，特別是當高頻、大振幅的力破壞αvβ3配體相互作用時。相比之下，在類似條件下，通過更高的親和力結(jié)合與αvβ6結(jié)合的細胞顯示出有限的轉(zhuǎn)變。分子模擬通過揭示整合素特異性反應的潛在機制來支持這些發(fā)現(xiàn)。該3D水凝膠平臺為研究癌癥細胞的機械傳導提供了強大的工具，并為開發(fā)靶向癌癥療法提供了潛在的見解。

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圖1：水凝膠平臺的設(shè)計和操作機制。

使用由分子致動器CD-PNIPAM配體功能化的3D DexMA水凝膠平臺進行細胞遷移操縱的示意圖，由NIR光調(diào)節(jié)。細胞球體被包裹在水凝膠中。當用兩種不同的亞型特異性擬肽配體進行功能化時——RGD用于αvβ3，RTDLDSLRT（簡稱RTD）用于αvα6——在不同的施力參數(shù)下4天后觀察到不同的細胞遷移模式。

圖2：用大分子致動器官能化的DexMA水凝膠的制備、機械和光熱性能。

DexMA水凝膠的制備和細胞包封過程的示意圖。b DexMA水凝膠的時變儲能模量（G′）和損耗模量（G〃）。c不同濃度交聯(lián)劑（NCD肽）對DexMA水凝膠儲能模量（G′）的影響。該研究包括每組三個重復實驗（n?=?3). d由DexMA和不同分子量的接枝CD-PNIPAM-RGD組成的水凝膠的溶脹行為。該研究包括每組三個重復實驗（n?=?3). e用CD-PNIPAM-RGD、CD-PDMA-RGD和PNIPAM-RGD官能化的DexMA水凝膠的紫外-可見-近紅外吸收光譜。f在808℃下用CD-PNIPAM-RGD、CD-PDMA-RGD和PNIPAM-RGD官能化的DexMA水凝膠光熱加熱期間獲得的代表性熱圖像?nm激光照射（6.6μW/μm2），比例尺=1?cm.g在808℃下用CD-PNIPAM-TTC官能化的DexMA水凝膠區(qū)域的溫度波動?nm激光曝光（6.6μW/μm2，1?Hz，10%占空比；地面溫度=29?°C），由紅外攝像頭拍攝。（b，c）中的數(shù)據(jù)以平均值表示??±??S.D.

圖3:DexMA 3D水凝膠中力刺激對細胞遷移的影響。

a-c移植CD-PNIPAM-RGD的DexMA 3D水凝膠中細胞的代表性亮場和熒光圖像。（a）、CD-PDMA-RGD（b）、PNIPAM-RGD（c），每種分子量為15?9.2以下的kDa?μW/μm2，10?Hz NIR照明在NIR照明期間隨時間跟蹤細胞。被照亮的區(qū)域由一個紅色虛線圓圈劃分。比例尺=50?μm.孵化溫度=25?°C.肌動蛋白和細胞核分別顯示為綠色和藍色。d描繪在兩個確定的感興趣區(qū)域內(nèi)，包封在與CD-PNIPAM-RGD共軛的水凝膠中的球體芽長隨時間平均相對增加的圖：ROI1（NIR照射）和ROI2（非照射）。 n?=?55,47個細胞。 ***P??<??0.001 e–f分別用CD-PDMA-RGD（e）和PNIPAM-RGD（f）官能化的對照水凝膠進行相同的實驗。ROI1（近紅外照明）和ROI2（非照明）。 n?=?55,從左到右分別為64、57、56個單元格。 ns p?=?0.32835, 0.40963.在三個獨立的實驗中，從至少12個細胞球體中收集了數(shù)據(jù)。g熒光成像顯示肌動蛋白（灰色）、vinculin（綠色）和整合素αVβ3（紅色）的表達。比例尺=200?μm用于10倍照片，20?μm用于放大照片。h在4個光照周期后，形成FA的細胞比例明顯更高。具有局灶性粘附的細胞是3個獨立實驗的統(tǒng)計結(jié)果，每個實驗3個球體。（d–f，h）中的數(shù)據(jù)以平均值表示??±??使用非配對單尾Student t檢驗比較每種條件下非照明和照明區(qū)域的S.D.數(shù)據(jù)。

圖4：各種條件下力誘導的細胞遷移。

不同NIR功率密度下細胞球體的熒光圖像。b不同脈沖頻率下細胞芽長的測量（n?=?33,33、30個細胞）。c脈沖頻率刺激下球體的熒光圖像。 *P?=?0.01272, ***P?<?0.001?d不同近紅外功率密度下芽長的測量（n?=?31,32、29個細胞）。 **P?=?0.00905, ***P?<?0.001 e不同致動器輪廓長度下球體的熒光圖像。f不同致動器輪廓長度下的芽長測量（n?=?31,35、30個細胞）。 ***P?<?0.001, ns P?=?0.94032 肌動蛋白和細胞核分別顯示為綠色和藍色。比例尺=100?μm.孵化溫度=25?°C.在每種條件下，在三個獨立的實驗中從至少八個細胞球體中收集數(shù)據(jù)。使用單因素方差分析（ANOVA）比較不同條件下的數(shù)據(jù)，然后進行Tukey的事后檢驗。CD-PNIPAM-RGD致動器的照明頻率、功率密度或分子量的增加顯著增強了細胞遷移，然而，超過一定閾值后，分子量的進一步增加并沒有帶來額外的改善。

圖5:CD-PNIPAM-RGD和CD-PNIPAM-MRT在強力作用下的不同細胞遷移模式示意圖。

a用CD-PNIPAM-RGD激活的整合素αvβ3的示意圖和顯示4天內(nèi)細胞遷移的延時明場圖像。比例尺：100?μm.b第4天的熒光圖像來自a.比例尺：100μm。c顯示與間充質(zhì)細胞相比，變形蟲細胞中SNAI1表達增強的代表性圖像。比例尺：10?μm.d與變形蟲細胞相比，間充質(zhì)細胞中E-cadherin表達增強的代表性圖像。肌動蛋白的免疫染色圖像以綠色突出顯示，細胞核（DAPI，4,6-二脒基-2-苯基吲哚）以藍色突出顯示，SNAI以黃色顯示，E-cadherin以紅色顯示。CD-PNIPAM-RTD激活的整合素αvβ6示意圖和延時明場照片顯示了4天內(nèi)的細胞遷移。比例尺：100?μm.f–h施力4天后，定量分析CD-PNIPAM-RGD或CD-PNIPAM-MTD功能化水凝膠中細胞的細胞表型分布，用于評估（f）脈沖頻率、（g）NIR功率密度和（h）致動器分子量（Mw）的影響。f–h每個數(shù)據(jù)點代表一個獨立的球體（生物復制，n?=?9 球體/組，3個實驗）。對于（f）*P?=?0.01565, *P?=?0.01766,ns=0.62788，ns=0.75417，（g）*P?=?0.03366 *P?=?0.01495, ns P?=?0.97658, ns P?=?0.58146 （h） **P?=?0.00126, *P?=?0.02328, ns P?=?0.84325, ns P?=?0.34575. i–k施力4天后細胞最大遷移長度的定量分析，用于評估i脈沖頻率、j近紅外功率密度和k致動器分子量（Mw）的影響。（i-k）每種情況的樣本量如下：（i）n?=?54,54、30、65、65、60個單元格（j）n?=?54,65、30、24、25、60個單元格（k）n?=?53,從左到右分別取9個球體中的48、30、51、50、60個細胞。對于（i）*P?=?0.04095, ***P?<?0.001, *P?=?0.04568, **P?=?0.0928,（g）*P?=?0.04611 ***P?<?0.001, *P?=?0.04282, ***P?<?0.001 （h） ***P?<?0.001, ***P?<?0.001, **P?=?0.0764, ***P?<?0.001. f-k中的數(shù)據(jù)以平均值表示??±??使用單因素方差分析（ANOVA）比較不同條件下的S.D.數(shù)據(jù)，然后進行Tukey的事后檢驗。對于CD-PNIPAM-RGD致動器，增加照明頻率、功率密度和致動器分子量會增強細胞MAT和遷移。相比之下，對于CD-PNIPAM-RTD致動器，這些增加改善了細胞遷移，但沒有顯著影響MAT比。

圖6：整合素-配體相互作用和力誘導解離動力學的計算分析。

a, b Interactions between the ligand motif and (a) αvβ3 integrin and (b) αvβ6 integrin (RGD/αvβ3 complex Protein Data Bank (PDB) ID: 1L5G, RTD/αvβ6 complex obtained from molecular docking). c The ligand bound to the integrin headpiece in a water box used for equilibration and steered molecular dynamics (SMD) simulations. d Force-induced dissociation trajectory of the ligand from integrin αvβ3 through steered molecular dynamics. The force profiles were obtained from five independent simulations, with the ligand being pulled away from integrin at a speed of v?=?0.06???ps?1 e Average peak force required for dissociation. For every group, the force calculated were from the same initial state of simulation but with different random seeds. The data in (e) is presented as mean values??±??S.D. ***P?=?0.000179.

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總結(jié)與展望

在這項研究中，我們通過將分子致動器CD-PNIPAM-RGD結(jié)合到基于葡聚糖的水凝膠中，擴展了我們之前的工作，創(chuàng)建了一個能夠在3D微環(huán)境中對特定細胞受體施加局部力的創(chuàng)新平臺。這些致動器利用一種將近紅外（NIR）光轉(zhuǎn)化為熱量的克羅科寧染料（CD）發(fā)色團，觸發(fā)熱響應性PNIPAM鏈收縮并對靶細胞受體施加張力。利用這一先進的系統(tǒng)，我們研究了不同的機械力參數(shù)——大小、頻率和持續(xù)時間——如何影響卵巢癌癥Hey細胞球體的遷移和侵襲行為。為了進一步了解特定整合素亞型在這些過程中的作用，我們用兩種不同的亞型特異性配體對致動器進行了功能化：αvβ3的RGD和αvβ6整合素的RTD。我們的研究結(jié)果表明，在細胞運動的早期階段，機械力的應用會增強集體細胞侵襲。此外，我們在后期觀察到顯著的間充質(zhì)到變形蟲的轉(zhuǎn)變（MAT），特別是當RGD-αvβ3復合物受到高頻和高振幅力時。相反，在相似條件下，通過RTD-αvβ6復合物刺激的細胞表現(xiàn)出最小的MAT。分子力學模擬進一步驗證了這些觀察結(jié)果，強調(diào)了特定力參數(shù)和整合素相互作用在調(diào)節(jié)細胞行為中的關(guān)鍵作用。值得注意的是，與其他方法相比，我們的方法具有明顯的優(yōu)勢：雖然光遺傳學/光機系統(tǒng)需要基因修飾或侵入性光活化，這會破壞天然細胞信號傳導，與3D水凝膠在化學上不相容，而且由于體力傳導（例如通過磁珠或電場），機電/磁力學方法通常缺乏分子尺度的精度，但我們的平臺能夠在3D環(huán)境中以更高的分子精度進行精確的非侵入性施力。這種能力使我們的系統(tǒng)成為機械轉(zhuǎn)導研究的有力工具，為特定受體亞型介導的初級機械刺激與細胞行為之間的關(guān)系提供了有價值的見解。因此，該平臺不僅深化了我們對細胞力學的基本理解，還為開發(fā)靶向治療策略和更復雜的仿生材料鋪平了道路。

文 獻

Li, B., Fu, Q., Lu, Y. et al. 3D hydrogel platform with macromolecular actuators for precisely controlled mechanical forces on cancer cell migration. Nat Commun 16, 4831 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-60062-3

來源：柔性電子與能源