《食品科學》：內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司田芳高級工程師等：液相色譜及離子色譜法測定嬰幼兒配方食品中母乳低聚糖的對比分析

母乳低聚糖（HMOs）是母乳中第三大固體成分，近年來已成為營養科學研究與產業應用的雙重熱點。多項臨床及體外研究表明，HMOs在調節腸道菌群、增強腸屏障功能、促進免疫系統和提高大腦及認知能力方面發揮健康益處。

全球主要監管機構已逐步批準多種HMOs在食品中的應用，美國食品藥品監督管理局和歐洲食品安全局分別將HMOs按照“一般認為安全”物質管理和“新食品原料”管理，并已批準8 種HMOs的使用：2’-巖藻糖基乳糖（2’-FL）、3-巖藻糖基乳糖（3-FL）、乳糖-N-四糖（LNT）、乳糖-N-新四糖（LNnT）、3’-唾液酸乳糖（3’-SL）、6’-唾液酸乳糖（6’-SL）、二巖藻糖基乳糖（DFL）和乳糖-N-巖藻五糖I（LNFP I）。我國國家衛生健康委員會于2023年批準2’-FL和LNnT可作為食品營養強化劑應用于嬰兒配方食品、較大嬰兒和幼兒配方食品、特殊醫學用途嬰兒配方食品和調制乳粉（僅限兒童用乳粉）中，2’-FL和LNnT在即食狀態下的使用量分別為0.7～2.4 g/L和0.2～0.6 g/L。2’-FL的使用范圍在2025年5月進一步擴展至嬰幼兒輔助食品。美國食品藥品監督管理局批準在嬰幼兒配方食品中，HMOs的最大使用量分別為2’-FL 2.4 g/L、3-FL 0.44～0.9 g/L、DFL（和2’-FL一起使用）1.2 g/L、LNT 0.8～1.5 g/L、LNnT 0.6 g/L、3’-SL 0.2 g/L、6’-SL 0.6 g/L和LNFP I 0.8 g/L。

建立使用范圍對應食品基質中HMOs的檢測方法，對提升食品安全水平、增強消費者信心及推動市場發展至關重要。目前，嬰幼兒配方食品中HMOs的檢測主要采用液相色譜法、離子色譜法和液相色譜-質譜法。液相色譜法具有高靈敏度和良好的方法適用性，離子色譜法因無需衍生化步驟且分離度高，近年來在食品安全、制藥等高精度檢測領域迅速普及。相比之下，液相色譜-質譜法雖具備極高的檢測靈敏度，但其廣泛應用受限于高昂的儀器成本、商品化同位素內標供應不足以及復雜食品基質潛在的干擾效應。因此，液相色譜法和離子色譜法在食品中HMOs的檢測中更具普適性和可操作性。

內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司的劉爽、陳剛、田芳*等分別建立液相色譜和離子色譜的檢測方法，用于測定7 種主要HMOs（2’-FL、3-FL、DFL、LNT、LNnT、3’-SL和6’-SL）。方法驗證包括牛乳基、羊乳基、豆基，以及整蛋白和水解蛋白配方體系在內的多種代表性嬰幼兒配方食品和牛乳基兒童奶粉，確保其在嬰幼兒配方食品和兒童乳粉檢測中的適用性。本研究通過系統評估兩種方法的技術性能和實用性，以期為后續研究者根據具體需求選擇適配的檢測方法提供科學的參考，為HMOs國標方法的制定提供重要支撐。

1 技術性能

1.1 液相色譜法

本研究基于文獻建立了液相色譜分析方法，并在建立過程中發現內標干擾和共洗脫干擾兩個會影響HMOs的準確定量的問題。針對上述問題，本研究實施了以下優化策略：1）引入用于添加GOS基質定量的內標甘露三糖，研究發現β-半乳糖苷酶可水解內標昆布三糖，90%的昆布三糖在加入β-半乳糖苷酶酶解液后會被酶解（圖1）。β-半乳糖苷酶可消除與6’-SL共洗脫的GOS干擾（圖2），但鑒于該酶同時會水解內標昆布三糖，本研究建立了雙內標體系。對于含GOS基質，使用β-半乳糖苷酶進行酶解，采用甘露三糖作為內標進行定量分析；對于僅使用淀粉轉葡萄糖苷酶酶解的基質，采用昆布三糖作為內標進行定量分析。2）優化柱溫條件，提高內標峰與雜質峰的分離度。本研究發現，在牛乳及牛乳基配方食品中，60 ℃柱溫條件下昆布三糖與雜質共洗脫（圖3A）。柱溫梯度實驗表明，52 ℃可實現內標昆布三糖與雜質峰基線分離（圖3B）。此外，60 ℃柱溫條件下進樣羊乳基質樣品時，6’-SL出峰位置存在雜質峰，升高柱溫（75 ℃）可有效分離此干擾峰（圖4）。基于此，本研究根據不同檢測需求設置了3 種柱溫——52、60 ℃和75 ℃。

液相色譜法驗證結果見表3，7 種HMOs在設定的質量濃度范圍內線性良好，決定系數＞0.999。當固態樣品取樣量為1 g，定容體積相當于225 mL時，7 種HMOs的檢出限為0.4～0.7 mg/100 g，定量限為1.8～3.6 mg/100 g；當液態樣品取樣量為1 g，定容體積相當于25 mL時，7 種HMOs的檢出限為0.05～0.08 mg/100 g，定量限為0.2～0.4 mg/100 g，定量限加標的回收率為81.1%～118.8%。正確度和重復性的評估通加在驗證基質中加標目標分析物，計算其回收率和相對標準偏差，方法的加標回收率為91.3%～108.0%，相對標準偏差為1.8%～2.8%。

1.2 離子色譜法

本研究基于文獻建立了離子色譜分析方法。在原有方法基礎上，新增了對DFL的驗證內容，使該方法能夠同時測定7 種HMOs。此外，通過優化樣品前處理步驟，增加β-半乳糖苷酶水解環節，消除了LNT色譜峰前的干擾峰（圖5），提高了方法的準確定量能力。特異性驗證評估了乳糖、蔗糖、GOS、FOS、水解乳清蛋白產物、酵母β-葡聚糖、N-乙酰神經氨酸和LNnT的酶解產物。在特異性驗證中發現，干擾物質有FOS、麥芽糊精和GOS。方法的試樣制備中加入果聚糖混合酶、淀粉轉葡糖苷酶和β-半乳糖苷酶。其中，果聚糖混合酶可分解FOS，消除FOS對2’-FL和6’-SL定量的影響（圖6），淀粉轉葡糖苷酶可分解麥芽糊精，消除3’-SL峰后的干擾物質，提高方法靈敏度。盡管GOS的出峰時間也出現（25 min）在LNnT出峰時間的前面，但因為GOS的峰與LNnT的分離度在1.2～1.5和β-半乳糖苷酶除分解GOS外，還會分解LNnT，因此β-半乳糖苷酶不用于LNnT的定量，只使用在含有GOS基質中LNT的測定。LNnT被β-半乳糖苷酶水解后的產物與7 種HMOs的出峰時間不重合，GOS被β-半乳糖苷酶水解后的產物與DFL的出峰時間重合，與其他6 種HMOs的出峰時間不重合。此外，在本研究建立的堿性洗脫條件下，3.77%峰面積的3’-SL和6’-SL發生異構化，轉化為3’-唾液酸乳果糖和6’-唾液酸乳果糖。這些異構體的出峰時間分別滯后于其對應的3’-SL和6’-SL。

離子色譜法驗證結果見表4，7 種HMOs在設定的質量濃度范圍內線性良好，決定系數＞0.999。當固態樣品取樣量為1 g，定容體積相當于225 mL時，7 種HMOs的檢出限為4.5～9 mg/100 g，定量限為18～36 mg/100 g；當液態樣品取樣量為1 g，定容體積相當于25 mL時，7 種HMOs的檢出限為0.5～1 mg/100 g，定量限為2～4 mg/100 g，定量限加標的回收率為80.7%～118.5%。正確度和重復性的評估通加為驗證基質中加標目標分析物，計算其回收率和相對標準偏差，方法的加標回收率為90.9%～109.4%，相對標準偏差為1.7%～3.7%。

1.3 技術性能比較

經建立并優化的液相色譜法與離子色譜法均能實現7 種目標HMOs的基線分離。通過考察多種潛在干擾物質，表明兩種方法特異性良好。兩種方法在較寬質量濃度范圍內均呈現良好的線性關系，建立的液相色譜和離子色譜的測定范圍一致。兩種方法的檢出限及定量限對比表明，液相色譜法的靈敏度較高，定量限為離子色譜法的1/10；測定范圍中間水平的加標回收實驗結果對比（表5）表明，在6 種基質中，液相色譜法與離子色譜法對7 種HMOs的平均回收率均在93.5%～106.5%之間，但液相色譜法中，3-FL回收率在牛乳基整蛋白、羊乳基整蛋白、牛乳基部分水解蛋白、添加GOS和FOS的牛乳基整蛋白嬰幼兒配方奶粉及添加GOS和FOS的牛乳基整蛋白兒童奶粉中顯著低于離子色譜（P＜0.05），3-FL在上述5 種基質中液相和離子色譜的平均回收率分別為95.2%和101.0%。離子色譜法中，DFL在牛乳基整蛋白、添加GOS和FOS的牛乳基整蛋白嬰幼兒配方奶粉和添加GOS和FOS的牛乳基整蛋白兒童奶粉中顯著低于液相色譜（P＜0.05），DFL在上述3 種基質中液相和離子色譜的平均回收率分別為101.7%和98.2%。精密度結果對比（表6）表明，兩種方法在6 種基質中的相對標準偏差均低于5.0%。

2 實用性

如表7所示，在可操作性方面，離子色譜法的樣品前處理流程較液相色譜法更為簡化，且對操作人員的技術門檻要求較低。在時效性方面，液相色譜法樣品處理時間約為離子色譜法的2.5 倍，離子色譜法儀器跑樣時間約為液相色譜法的1.3 倍，液相色譜法在單次檢測耗時上比離子色譜法多約40 min。在成本效益方面，離子色譜儀的初始購置成本高于液相色譜儀，但二者的試劑與耗材成本基本一致。

3 討論

本研究分別建立了液相色譜法和離子色譜法，用于測定嬰幼兒配方食品中7 種HMOs。兩種方法在特異性、線性及測定范圍方面性能相當，測定范圍加標的平均回收率均在93.5%～106.5%之間，相對標準偏差均低于5.0%，表明兩種方法均適用于嬰幼兒配方食品中7 種HMOs的定量分析。技術性能比較結果表明，液相色譜法的檢出限與定量限均低于離子色譜法，更適用于嬰幼兒配方乳粉中HMOs本底含量的檢測；對于羊乳基配方食品，因液相色譜法需使用3 種柱溫程序及雙內標系統，操作流程復雜，推薦優先采用離子色譜法以簡化流程；在3-FL檢測中，3-FL在牛乳基整蛋白、羊乳基整蛋白、牛乳基部分水解蛋白、添加GOS和FOS的牛乳基整蛋白嬰幼兒配方奶粉及添加GOS和FOS的牛乳基整蛋白兒童奶粉中顯著低于離子色譜，可能的原因有液相色譜法因3-FL色譜峰位于梯度洗脫斜坡，且還原端乳糖連接的巖藻糖基團導致衍生效率降低，故建議3-FL定量優先選擇離子色譜法。實用性比較結果表明，離子色譜法在操作便捷性及分析時效性方面更具優勢；盡管其設備初始投入成本較高，但日常運行所需的試劑與耗材成本與液相色譜法相當。本研究填補了液相色譜與離子色譜法檢測HMOs系統性對比的空白，盡管兩種方法已被應用于HMOs的檢測，但鮮有研究在統一的實驗平臺及相同的驗證基質下，對兩種方法的性能參數進行系統比較。本研究提供的對比分析結果明確了兩種方法各自的優勢及適用場景，為其在實際食品安全工作中方法的選擇提供了重要參考。

在液相色譜法中，針對昆布三糖內標會被酶解及與雜質共洗脫影響準確定量的問題，本研究引入了雙內標（昆布三糖+甘露三糖）定量策略。本研究發現約90%的昆布三糖內標在加入有β-半乳糖苷酶酶解液后會被酶解，表明傳統單內標策略存在潛在問題。因此在使用β-半乳糖苷酶的基質中，引入了甘露三糖內標。雙內標定量的策略確保了在不同酶解條件下的檢測準確性和可靠性。

在離子色譜法中，本研究通過優化梯度洗脫程序以及特異性酶解體系實現7 種HMOs的測定，可測定的HMOs種類從文獻報道的6 種（不包含DFL）和《食品中母乳低聚糖的測定（征求意見稿）》第二法離子色譜法的2 種（2’-FL和LNnT）擴展至7 種，提升了離子色譜法的應用范圍和實用性。DFL是母乳中含量第10位的HMO，Salli等的微生物代謝研究表明，DFL不支持大腸桿菌E94564T、阪崎腸桿菌DSM 4485和腸沙門氏菌腸亞種NCTC 4840等潛在致病菌的生長。2019年5月，歐洲食品安全局批準了2’-FL/DFL混合原料添加進食品中。基于DFL天然存在于母乳中的生物學特性、已被證實的健康益處以及當前法規批準現狀，其在食品工業中的應用前景廣闊。為此，本研究在方法學驗證中增加了對DFL的驗證，以擴大方法的可測定HMOs的范圍。方法驗證結果表明，DFL在測定范圍中間水平的加標回收率為95.5%～104.1%，相對標準偏差為2.4%，方法具有良好的正確度和精密度，能滿足分析要求。在梯度洗脫程序優化上，采用多階段梯度洗脫策略，初始階段采用等度洗脫，線性梯度階段實現中性巖藻糖基化HMO（3-FL、DFL、2’-FL）的洗脫，平衡階段完成中性非巖藻糖基化HMO（LNnT、LNT）的分離，強化階段實現酸性唾液酸化HMOs（6’-SL、3’-SL）的洗脫。該梯度程序通過動態調節淋洗液的離子強度，使不同電荷密度的HMO依次洗脫。在特異性酶解體系上，方法加入了果聚糖混合酶、β-半乳糖苷酶和淀粉轉葡糖苷酶，分別水解FOS、GOS和麥芽糊精，通過水解干擾峰，提高方法的特異性和目標分析物的分離度，實現7 種HMOs的準確定量。

本研究發現在一定使用量和酶解條件下β-半乳糖苷酶不會水解LNT。Bénet等研究發現，在該方法的酶解條件下β-半乳糖苷酶可部分水解LNT和LNnT產生乳糖-N-三糖。β-半乳糖苷酶可水解GOS，GOS是一類非消化性的低聚糖，多篇研究報道了GOS在促進有益菌增殖、抑制病原體黏附以及改善腸道屏障功能方面的健康益處。目前，GOS已廣泛使用在嬰幼兒配方食品和其他食品類別中，但是，GOS因其結構特性在離子色譜和液相色譜法中均會影響HMO的測定。離子色譜法中，GOS在LNT時間前出峰，在本研究中樣品預處理的條件下，每80 μL樣品加入32單位的β-半乳糖苷酶，40 ℃條件下酶解45 min，可水解GOS但不會破壞LNT，且GOS被水解后的產物不會影響7 種HMO的定量。但是在液相色譜法的樣品預處理的條件下（每4 μL樣品加入80單位的β-半乳糖苷酶，60 ℃條件下酶解60 min），GOS和LNT都會被全部水解。β-半乳糖苷酶可部分水解LNT和LNnT已有報道，但本研究報道了降低β-半乳糖苷酶的使用量和改變酶解條件可使LNT不被降解，使方法在消除GOS的干預上又能準確定量。此外，本研究中的2 種β-半乳糖苷酶的酶解條件也為進一步優化HMO檢測方法提供了理論依據。

本研究補充了現有方法未考察的特異性驗證——3’-唾液酸乳果糖和6’-唾液酸乳果糖。這兩種化合物可分別由3’-SL和6’-SL在堿性條件（pH＞9）下異構生成。其形成機制是3’-SL和6’-SL（結構分別為唾液酸通過α2-3或α2-6糖苷鍵連接至乳糖的半乳糖端）分子中乳糖的葡萄糖基發生異構化，轉化為果糖基。離子色譜法采用堿性溶液作為洗脫液，存在誘發上述異構化的風險。在使用建立的離子色譜方法下，3’-SL和6’-SL異構化的比例為3.77%。液相色譜法中，異構化的產物與7 種HMOs出峰時間均不重合。因此，在進行離子色譜數據處理時，建議扣除相應峰面積的積分值，以排除異構體干擾。

本研究發現牛羊乳基的配方食品中天然存在3’-SL（13～60 mg/100 g，該數據文中未列出）。哺乳動物乳汁中存在低聚糖，其結構多樣性和含量均與母乳中的低聚糖存在差異。哺乳動物乳汁中唾液酸化低聚糖占優勢地位，而母乳中45%～83%的低聚糖為巖藻糖基化HMO。母乳中HMOs的質量濃度為5～20 g/L，牛乳、山羊乳和綿羊乳分別為30～60、60～350 mg/L和20～40 mg/L。3’-SL是牛乳中含量最高的低聚糖，在牛乳、山羊乳和綿羊乳中的質量濃度分別為58、12 mg/L和2 mg/L。母乳中含量最高的為2’-FL，質量濃度為935～2 865 mg/L，3’-SL質量濃度為106～228 mg/L。本研究使用神經氨酸酶（CAS號：9001-67-6）驗證了牛羊乳基質在3’-SL標準品出峰時間上對應的峰為3’-SL，神經氨酸酶可裂解末端α2-3、2-6和2-8糖苷鍵鏈接的N-乙酰神經氨酸。本研究的結果支持了牛羊乳基的配方食品含有天然3’-SL，檢測添加3’-SL的嬰幼兒配方食品時，應考慮到乳粉中3’-SL的本底含量。

本研究建立的方法未來還可進一步優化，逐步擴大對HMOs組分的覆蓋范圍。母乳中已鑒定出200多種結構的HMOs，隨著新種類HMOs陸續獲批并投入工業化生產，開發配套的檢測技術將成為保障產品質量的關鍵環節。同時，HMOs檢測需求正從母乳基質向多元化食品體系延伸。目前，HMOs的檢測方法的應用范圍主要是嬰幼兒配方食品（包括特殊醫學用途嬰兒配方食品）和調制乳粉。然而，HMOs在飲料、谷物制品、功能性食品等其他類別中的應用已在歐美國家推進。自2018年起，添加HMOs的營養飲品、代餐飲品、酸奶、膳食補充劑等陸續在美國、西班牙、澳大利亞、德國、越南、韓國、南非和泰國上市。針對上述新興應用場景的HMOs檢測方法研究尚屬空白，其樣品前處理及色譜條件優化面臨存在一定挑戰性。未來工作需建立適配不同食品基質的檢測方法，為行業規范制定與食品安全監管提供技術支撐。

4 結論

本研究分別建立了液相色譜法和離子色譜法，用于測定嬰幼兒配方食品中的HMOs。在液相色譜法中，引入雙內標定量策略以提高檢測準確性；在離子色譜法中，通過優化梯度洗脫程序并建立特異性酶解體系，實現7 種HMOs的準確定量。兩種方法的技術性能評估和實用性評價結果表明，液相色譜法和離子色譜法在特異性、測定范圍、正確度和重復性方面表現相當，均適用于嬰幼兒配方食品中7 種HMOs的定量分析；液相色譜法在低含量HMOs檢測中更具優勢（如乳粉的本底HMOs測定）；離子色譜法在3-FL的回收率方面表現更優，且對于羊乳基嬰幼兒配方食品的樣品前處理和儀器條件更具操作簡便性。此外，特定使用量和酶解條件下β-半乳糖苷酶不會水解LNT以及3’-唾液酸乳果糖和6’-唾液酸乳果糖的特異性驗證結果。同時，牛乳和羊乳基嬰幼兒配方食品中天然存在3’-SL，提示在檢測添加3’-SL的嬰幼兒配方食品時，需考慮其本底含量的影響。本研究的數據有助于推動HMOs檢測方法的推廣與應用，為相關科學研究與產品開發提供技術支撐。未來工作需擴大可檢測HMOs種類，以及建立其他食品基質中的檢測方法，以應對其快速發展的批準與應用趨勢。

作者簡介

通信作者

田芳，高級工程師，內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司-全球研發創新中心-營養科學研究院-分析研究總監， 2013年畢業于美國馬薩諸塞大學阿默斯特分校，獲食品科學博士學位。先后就職于雅培、蒙牛等公司，長期專注于營養品的研發工作。其主要專長涵蓋母乳研究、營養品分析與應用、分析方法開發及標準制修訂等領域，并在國內外知名學術期刊上發表論文50余篇。

第一作者

劉爽，內蒙古蒙牛乳業（集團）股份有限公司-全球研發創新中心-營養科學研究院-分析研究中級工程師。2024年畢業南開大學醫學院，獲生物化學與分子生物學博士學位，博士期間主要從事益生元和益生菌的健康作用及互作機制方向的研究。此后，任職于蒙牛公司，主要從事營養素檢測的研究，在營養品分析與應用方面積累了豐富的經驗。

引文格式：

劉爽, 陳剛, 張影, 等. 液相色譜及離子色譜法測定嬰幼兒配方食品中母乳低聚糖的對比分析[J]. 食品科學, 2025, 46(23): 311-320. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250630-211.

LIU Shuang, CHEN Gang, ZHANG Ying, et al. Comparative study of liquid chromatography and ion chromatography for the determination of human milk oligosaccharides in infant formula[J]. Food Science, 2025, 46(23): 311-320. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250630-211.

實習編輯：楊瓊；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網

為系統提升我國食品營養與安全的科技創新策源能力，加速科技成果向現實生產力轉化，推動食品產業向綠色化、智能化、高端化轉型升級，由北京食品科學研究院、中國食品雜志社《食品科學》雜志（EI收錄）、中國食品雜志社《Food Science and Human Wellness》雜志（SCI收錄）、中國食品雜志社《Journal of Future Foods》雜志（ESCI收錄）主辦，合肥工業大學、安徽農業大學、安徽省食品行業協會、安徽大學、合肥大學、合肥師范學院、北京工商大學、中國科技大學附屬第一醫院臨床營養科、安徽糧食工程職業學院、安徽省農科院農產品加工研究所、安徽科技學院、皖西學院、黃山學院、滁州學院、蚌埠學院共同主辦的“ 第六屆食品科學與人類健康國際研討會 ”，將于 2026年8月15-16日（8月14日全天報到） 在 中國 安徽 合肥 召開。

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