NBE丨李偉/王皓毅/王晨鑫合作開發(fā)安全高效的基因?qū)懭胄录夹g(shù)PAINT?與PRIME-In

2026年4月 30 日，Nature Biomedical Engineering發(fā)表了題為Non-viral targeted integration of large DNA in primary human T cells independent of double-stranded DNA breaks的研究論文，報(bào)道了一種名為 PRIME-In 的新型基因編輯平臺(tái)。該平臺(tái)無需引發(fā)基因組 DNA 雙鏈斷裂，即可將大片段外源 DNA 高效、精準(zhǔn)地整合到人類原代 T 細(xì)胞的基因組中，為安全、高效的非病毒 CAR-T 細(xì)胞制備提供了全新解決方案。

如何在基因組中實(shí)現(xiàn)大片段基因的靶向精準(zhǔn)寫入？這在基因和細(xì)胞治療等領(lǐng)域有著廣泛重大的需求，但是目前在技術(shù)上仍然存在許多挑戰(zhàn)。李偉團(tuán)隊(duì) 2023 年首次在Cell Discovery 報(bào)道了PAINT（Primed micro-homologues-assisted integration）技術(shù)，其核心原理是發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了供體末端的單鏈微同源臂可以大幅提升供體 DNA 的同源整合效率：即利用先導(dǎo)編輯器在供體質(zhì)粒上生成與基因組特定位點(diǎn)同源的 3′單鏈微同源臂，再通過基因組對(duì)應(yīng)位點(diǎn)雙鏈斷裂促進(jìn)供體質(zhì)粒上的外源基因在基因組上的整合。借助 PAINT 方法，團(tuán)隊(duì)在多種細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了遠(yuǎn)超傳統(tǒng) HDR 策略的靶向整合效率，將長(zhǎng)度為 2.5 kb 的轉(zhuǎn)基因以高達(dá) 80% 的整合效率插入基因組，并在原代 T 細(xì)胞中成功制備了具有特異性腫瘤殺傷能力的功能性 CAR-T 細(xì)胞，充分驗(yàn)證了單鏈微同源臂策略的巨大潛力。

PAINT系統(tǒng)工作模式圖

在此次發(fā)表的論文中，合作團(tuán)隊(duì)對(duì)PAINT 技術(shù)進(jìn)行了多輪升級(jí)開發(fā)了PRIME-In 技術(shù)。PRIME-In 平臺(tái)巧妙繞開了雙鏈斷裂。它利用先導(dǎo)編輯器在質(zhì)粒供體上生成一段稱為“微同源臂”的單鏈突起，同時(shí)僅讓基因組上產(chǎn)生一個(gè)小切口，兩者配對(duì)后引導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)源 DNA 聚合酶完成長(zhǎng)片段合成與整合。整個(gè)過程無DNA雙鏈斷裂修復(fù)途徑的參與，從源頭上規(guī)避了由此帶來的基因毒性。

PRIME-In 系統(tǒng) 工作模式圖

經(jīng)過編輯器設(shè)計(jì)、供體優(yōu)化和遞送組分的系統(tǒng)提升，PRIME-In 在細(xì)胞系中實(shí)現(xiàn)了最高85% 的定點(diǎn)整合效率，并能處理長(zhǎng)達(dá)10 kb 的大片段。針對(duì)原代 T 細(xì)胞，團(tuán)隊(duì)通過引入密碼子優(yōu)化的分裂型先導(dǎo)編輯器 mRNA、抑制機(jī)體 DNA 感知的病毒蛋白 UL36/UL37x1 以及先天免疫抑制劑 A151等，顯著降低了質(zhì)粒毒性，使報(bào)告基因的敲入效率達(dá)到約 60%，CAR 的整合效率達(dá)到約 50%，并在 7 天內(nèi)獲得相當(dāng)于起始數(shù)量 11 倍的工程化 T 細(xì)胞。

高通量測(cè)序顯示，PRIME-In 在原代T細(xì)胞編輯中的基因組整合精確度超過 99%，幾乎不引發(fā)染色體易位和脫靶整合，編輯副產(chǎn)物遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)的HMEJ等方法。雙鏈斷裂的避免也使得 p53 介導(dǎo)的凋亡通路不被過度激活，T 細(xì)胞的活力和擴(kuò)增能力因此得到更好保留。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，PRIME-In 構(gòu)建的 CD19 CAR-T 細(xì)胞能夠有效清除小鼠體內(nèi)的 Raji 腫瘤，其中靶向 AAVS1 位點(diǎn)的 CAR-T 細(xì)胞在長(zhǎng)期腫瘤控制和功能持續(xù)方面表現(xiàn)尤為突出，療效與慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的 CAR-T 細(xì)胞相當(dāng)。此外，該方法還展示了在人胚干細(xì)胞等多類型細(xì)胞中的應(yīng)用潛力。

PRIME-In 介導(dǎo)的基因?qū)懭敫咝Ь珳?zhǔn)，規(guī)避了現(xiàn)有的非病毒定點(diǎn)整合方法必須切斷基因組雙鏈所引發(fā)的染色體易位、大片段缺失及細(xì)胞凋亡等問題，為CAR-T 細(xì)胞療法等基因編輯細(xì)胞藥物的生產(chǎn)提供了更安全、更高效的策略。

中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所研究生方森、助理研究員唐娜、研究生李伊蕓和郭書宇、博士后陳陽燦為該文章共同第一作者，李偉研究員、王晨鑫副研究員和王皓毅研究員為共同通訊作者。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1038/s41551-026-01671-1

https://doi.org/10.1038/s41421-023-00552-0

制版人： 十一

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