Chin Med I 丹酚酸B靶向Smad7去泛素化重塑TGF-β/Smad信號軸，強效逆轉(zhuǎn)糖尿病性心肌病心肌纖維化 (沈祥春-貴州醫(yī)科大學(xué))

2023年12月，貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院/藥學(xué)院沈祥春團隊聯(lián)合實驗動物中心，在Chinese Medicine （中科院2區(qū)，IF=5.7）在線發(fā)表題為 “Salvianolic acid B ameliorates myocardial fibrosis in diabetic cardiomyopathy by deubiquitinating Smad7” 的研究論文。該研究聚焦糖尿病性心肌病中心肌纖維化這一關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)，圍繞丹參主要水溶性活性成分丹酚酸B（Sal B）的心肌保護作用及分子機制展開系統(tǒng)研究。

研究團隊通過高脂高糖飲食聯(lián)合低劑量鏈脲佐菌素構(gòu)建2型糖尿病性心肌病小鼠模型，并結(jié)合高糖誘導(dǎo)的心臟成纖維細胞模型，從體內(nèi)和體外兩個層面驗證 Sal B 的抗纖維化效應(yīng)。結(jié)果顯示，Sal B 能顯著改善 DCM 小鼠心功能，降低心臟肥大和左心室擴張程度，減少心肌炎癥細胞浸潤、膠原沉積及 α-SMA 表達，從而緩解心肌纖維化進展。

機制上，該研究進一步發(fā)現(xiàn)，Sal B 并非主要通過促進 Smad7 mRNA 轉(zhuǎn)錄來提高其表達，而是通過抑制 Smad7 泛素化降解，穩(wěn)定 Smad7 蛋白水平，進而阻斷 TGF-β1/Smad 信號通路的過度激活。細胞實驗同樣表明，Sal B 可抑制高糖誘導(dǎo)的心臟成纖維細胞增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)化及膠原分泌，提示其具有直接干預(yù)纖維化核心效應(yīng)細胞的潛力。

該研究首次從 “Smad7去泛素化—TGF-β1/Smad信號軸—心肌纖維化” 角度闡明 Sal B 改善糖尿病性心肌病的潛在機制，為丹參活性成分防治糖尿病相關(guān)心血管并發(fā)癥提供了新的實驗依據(jù)，也為中藥單體靶向干預(yù)心肌纖維化提供了重要思路。

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【摘要】

背景
丹酚酸B（Salvianolic acid B，Sal B）是來源于丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）的一種水溶性酚類化合物，在中醫(yī)中常用于治療心血管疾病。我們此前的研究表明，Sal B 可保護機體免受糖尿病性心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）誘導(dǎo)的心肌纖維化損傷。本研究旨在探討 Sal B 改善 DCM 誘導(dǎo)的心肌纖維化的作用及其潛在機制。

方法
本研究采用多種體內(nèi)和體外實驗方法，研究 Sal B 對 DCM 誘導(dǎo)的心肌纖維化的影響。這些方法包括血糖測定、超聲心動圖、HE 染色、Masson 三色染色、天狼星紅染色、細胞增殖檢測、羥脯氨酸水平測定、免疫組織化學(xué)染色、纖維化相關(guān)蛋白表達檢測，包括 Collagen-I、Collagen-III、TGF-β1、p-Smad3、Smad3、Smad7 和 α-平滑肌肌動蛋白，以及 Smad7 基因表達分析和 Smad7 泛素化修飾分析。

結(jié)果
動物實驗結(jié)果表明，Sal B 可顯著改善心功能，抑制膠原沉積和表型轉(zhuǎn)化，并通過上調(diào) Smad7 抑制 TGF-β1 信號通路，從而改善 DCM 中的心肌纖維化。此外，細胞實驗顯示，Sal B 可顯著抑制高糖（HG）誘導(dǎo)的心臟成纖維細胞（cardiac fibroblasts，CFs）的增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)化和膠原分泌。Sal B 顯著降低 Smad7 的泛素化水平并穩(wěn)定 Smad7 蛋白表達，從而提高 CFs 中 Smad7 蛋白表達，并抑制 TGF-β1 信號通路。這可能是 Sal B 緩解 DCM 誘導(dǎo)心肌纖維化的潛在機制。

結(jié)論
本研究揭示，Sal B 可通過去泛素化 Smad7、穩(wěn)定 Smad7 蛋白表達并阻斷 TGF-β1 信號通路，從而改善 DCM 中的心肌纖維化。

關(guān)鍵詞
丹酚酸B；糖尿病性心肌病；心肌纖維化；TGF-β1 信號通路；Smad7 去泛素化。

01

研究背景及科學(xué)問題

自 20 世紀(jì) 50 年代以來，糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)急劇上升，并已成為重要的公共衛(wèi)生問題。2021 年，中國糖尿病患者人數(shù)達到 1.409 億，這意味著每五人中就有一人患有糖尿病。糖尿病性心肌?。―CM）由糖尿病引起，是全球發(fā)病和死亡的重要原因之一，并導(dǎo)致超過 50% 的糖尿病相關(guān)死亡。

心肌纖維化是 DCM 的主要病理改變。心肌纖維化的病理特征包括細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）過度沉積，導(dǎo)致心室壁增厚和僵硬，進一步引發(fā)心力衰竭、心功能障礙、心律失常和心肌梗死，最終導(dǎo)致心血管死亡。心臟成纖維細胞（CFs）由于參與 ECM 的更新，是心臟纖維化瘢痕形成的主要效應(yīng)細胞之一。當(dāng)發(fā)生心肌纖維化時，CFs 的增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)化和膠原分泌均顯著增強。

CFs 向肌成纖維細胞分化是心肌纖維化中的關(guān)鍵過程，其中 α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）被認為是肌成纖維細胞分化的標(biāo)志物。肌成纖維細胞在纖維化過程中膠原沉積中發(fā)揮重要作用。因此，抑制 CFs 的增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)化和膠原分泌，是減輕心肌纖維化的重要策略。

此外，TGF-β1 信號通路是 DCM 纖維化發(fā)生機制中最重要的靶點。抑制 TGF-β1 信號通路可顯著改善 DCM 中的心肌纖維化。Smad7 是 TGF-β1 信號通路中的關(guān)鍵負反饋調(diào)節(jié)因子。Smad7 可通過抑制受體調(diào)節(jié)型 Smads，如 Smad3 的磷酸化，阻斷 TGF-β1 信號通路。大量證據(jù)表明，當(dāng) Smad7 表達下調(diào)時，心肌纖維化會顯著加重。

然而，目前尚無針對 DCM 誘導(dǎo)心肌纖維化的有效治療方案。丹酚酸B（Sal B）是丹參中的一種酚類化合物，丹參在中醫(yī)中常用于治療心血管疾病。Sal B 由三個丹參素分子和一個咖啡酸分子組成。由于其結(jié)構(gòu)中含有多個酚羥基，Sal B 具有抗氧化特性。我們此前研究表明，Sal B 對 DCM 誘導(dǎo)的心肌纖維化具有潛在保護作用。

本研究通過體內(nèi)和體外實驗，探討 Sal B 對 DCM 心肌纖維化的改善作用及其潛在機制，為 Sal B 改善 DCM 誘導(dǎo)的心肌纖維化提供證據(jù)，并促進中醫(yī)藥在臨床中的應(yīng)用。

02

重要發(fā)現(xiàn)及亮點

1. Sal B 改善 DCM 小鼠心功能

采用高脂高糖飲食聯(lián)合低劑量鏈脲佐菌素（STZ）建立 2 型糖尿病模型。與對照組相比，高脂高糖飲食小鼠表現(xiàn)出明顯的葡萄糖耐量受損和胰島素抵抗。STZ 誘導(dǎo)后，小鼠血糖顯著升高，當(dāng)血糖濃度超過 11.1 mmol/L 時，確認 2 型糖尿病模型建立成功。

與對照組相比，造模 8 周后 DCM 小鼠的射血分數(shù)（EF）降低，提示 DCM 小鼠模型成功建立。DCM 小鼠心臟出現(xiàn)左心室肥厚和左心室擴張，心臟臟器指數(shù)顯著升高。然而，Sal B 和二甲雙胍（Met）治療后，心臟肥大和左心室擴張明顯改善，Sal B 和 Met 治療組小鼠的心臟臟器指數(shù)顯著低于 DCM 組。

心臟超聲結(jié)果顯示，DCM 小鼠心臟的左心室收縮末期容積（LVESV）和左心室舒張末期容積（LVEDV）顯著增加，而 EF 和短軸縮短率（FS）顯著下降。Sal B 和 Met 治療后，上述指標(biāo)均得到改善。綜上，Sal B 可顯著改善 DCM 小鼠的心功能。

圖1 圖注翻譯：Sal B 對 DCM 小鼠心功能障礙的影響。
A：腹腔葡萄糖耐量試驗（IPGTT）；
B：血糖曲線下面積（AUC）；
C：高脂高糖飲食喂養(yǎng) 3 個月后觀察到胰島素抵抗（HOMA-IR）；
D：2 型糖尿病模型血糖水平；
E：DCM 小鼠心臟解剖圖；
F：DCM 小鼠心臟臟器指數(shù)；
G：二維和 M 型超聲心動圖代表性圖像；
H–K：小鼠心臟 LVESV、LVEDV、EF、FS 的定量結(jié)果。
N=8。數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組比較采用單因素方差分析，并進行 Tukey 檢驗。<0.05，#<0.01 vs. 對照組；*p<0.05，**p<0.01 vs. DCM 組。

2. Sal B 抑制 DCM 小鼠炎癥細胞浸潤、膠原沉積、表型轉(zhuǎn)化及 TGF-β1 信號通路

組織學(xué)檢查顯示，DCM 小鼠存在明顯的心肌肥大和炎癥細胞浸潤；而 Sal B 和 Met 治療后，心肌肥大和炎癥細胞浸潤明顯改善。

心肌纖維化的特征是纖維性細胞外基質(zhì)蛋白，尤其是 I 型膠原（Col-I）和 III 型膠原（Col-III）的過度沉積。Masson 染色和天狼星紅染色顯示，DCM 小鼠心肌組織中存在大量膠原沉積，而 Sal B 和 Met 治療可顯著減少膠原沉積。

通過計算 Masson 三色染色后纖維化面積與總組織面積的比值，對心肌纖維化程度進行定量。結(jié)果顯示，與 Sal B 和 Met 治療組相比，DCM 組心肌組織中的纖維化面積比例顯著升高。

Western blot 結(jié)果同樣顯示，DCM 小鼠心肌組織中 Col-I 和 Col-III 表達顯著上調(diào)；Sal B 和 Met 治療后，小鼠心肌組織中 Col-I 和 Col-III 表達顯著下調(diào)，提示 Sal B 可顯著減少膠原分泌。

肌成纖維細胞在纖維化過程中產(chǎn)生更多膠原，并負責(zé)膠原沉積。通過檢測 α-SMA 表達評估成纖維細胞向肌成纖維細胞的分化。Western blot 結(jié)果顯示，DCM 小鼠心肌組織中 α-SMA 表達顯著上調(diào)；Sal B 和 Met 治療后，α-SMA 表達顯著下調(diào)，提示 Sal B 可顯著降低 DCM 小鼠中的表型轉(zhuǎn)化。

此外，Western blot 結(jié)果顯示，DCM 小鼠心肌組織中 TGF-β1、p-Smad3 和 Smad3 表達顯著上調(diào)，而 Smad7 表達顯著下調(diào)。Sal B 和 Met 治療后，TGF-β1、p-Smad3 和 Smad3 表達顯著下調(diào)，Smad7 表達顯著上調(diào)。這表明 Sal B 通過上調(diào) Smad7 抑制 TGF-β1 信號通路，從而顯著改善 DCM 小鼠心肌纖維化。

圖2 圖注翻譯：Sal B 對 DCM 小鼠炎癥細胞浸潤和膠原沉積的影響。
A–C：心臟組織 HE 染色、Masson 染色和天狼星紅染色；
D：Masson 三色染色膠原面積定量分析；
E：心肌纖維化相關(guān)蛋白表達水平；
F、G：蛋白表達定量結(jié)果。
所有蛋白表達均以 GAPDH 進行歸一化。N=8。數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組比較采用單因素方差分析，并進行 Tukey 檢驗。<0.05，#<0.01 vs. 對照組；*p<0.05，**p<0.01 vs. DCM 組。

3. 原代新生大鼠心臟成纖維細胞的鑒定與形態(tài)觀察

顯微鏡下觀察，新生大鼠心臟成纖維細胞呈梭形，并具有多個突起。通過免疫細胞化學(xué)檢測 CFs 的特異性標(biāo)志物波形蛋白（vimentin），可見其絲狀結(jié)構(gòu)。用 PBS 代替抗 vimentin 抗體處理的陰性對照細胞未顯示紅色熒光，僅顯示藍色細胞核染色。相反，使用抗 vimentin 抗體染色的原代細胞表現(xiàn)出強烈紅色熒光，并伴有藍色核染色，證實 vimentin 的存在。定量分析顯示，95% 的細胞 vimentin 呈陽性。

圖3 圖注翻譯：原代新生大鼠心臟成纖維細胞的鑒定與形態(tài)。
A：培養(yǎng) 3 天后的 CFs 生長情況；
B：陰性對照；
C：vimentin 陽性細胞。

4. Sal B 抑制高糖誘導(dǎo)的 CFs 增殖

與對照組相比，40 mM 和 45 mM 葡萄糖顯著增強 CFs 增殖。既往研究提示，40 mM 葡萄糖是誘導(dǎo) CFs 增殖的最佳濃度。細胞增殖檢測和 HE 染色結(jié)果表明，Sal B 在 12.5–50 μM 濃度范圍內(nèi)可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的 CFs 增殖。

圖4 圖注翻譯：Sal B 對高糖誘導(dǎo) CFs 增殖的影響。
A：高糖誘導(dǎo)心臟成纖維細胞增殖的劑量效應(yīng)關(guān)系；
B：使用 xCELLigence 實時細胞分析儀檢測 Sal B 對高糖誘導(dǎo) CFs 細胞指數(shù)的影響，檢測時間為 0–120 h；
C：Sal B 對高糖誘導(dǎo) CFs 細胞指數(shù)的影響，檢測時間為 24 h；
D：HE 染色。
細胞實驗重復(fù) 3 次。數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組比較采用單因素方差分析，并進行 Tukey 檢驗。<0.05，#<0.01 vs. 對照組；*p<0.05，**p<0.01 vs. DCM 組。

5. Sal B 降低 CFs 的遷移和羥脯氨酸分泌

采用細胞劃痕實驗檢測 Sal B 對高糖誘導(dǎo) CFs 遷移的影響。與對照組相比，高糖顯著增強 CFs 的遷移能力，而 Sal B 可顯著抑制高糖誘導(dǎo)的 CFs 遷移能力。

通過測定心肌羥脯氨酸濃度評估心肌膠原含量。與對照組相比，高糖顯著增加 CFs 的羥脯氨酸分泌；Sal B 則顯著抑制高糖誘導(dǎo)的 CFs 羥脯氨酸分泌。

圖5 圖注翻譯：Sal B 對高糖誘導(dǎo) CFs 遷移和羥脯氨酸分泌的影響。
A：Sal B 對高糖誘導(dǎo)的新生大鼠 CFs 遷移的影響，檢測時間為 24 h；
B：遷移結(jié)果定量分析；
C：Sal B 對高糖誘導(dǎo) CFs 羥脯氨酸分泌的影響。
細胞實驗重復(fù) 3 次。數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組比較采用單因素方差分析，并進行 Tukey 檢驗。<0.05，#<0.01 vs. 對照組；*p<0.05，**p<0.01 vs. DCM 組。

6. Sal B 抑制高糖誘導(dǎo) CFs 中心肌纖維化及 TGF-β1 信號通路相關(guān)蛋白，并增加 Smad7 表達

與對照組相比，高糖誘導(dǎo)的 CFs 中 Col-I、Col-III、TGF-β1、p-Smad3、Smad3 和 α-SMA 蛋白水平均顯著升高；Sal B 可顯著降低這些蛋白水平。

結(jié)果表明，Sal B 可顯著增加高糖誘導(dǎo) CFs 中 Smad7 的表達，并抑制 TGF-β1 信號通路。Sal B 顯著提高 Smad7 表達，這與免疫熒光染色結(jié)果一致。

圖6 圖注翻譯：Sal B 對高糖誘導(dǎo) CFs 中心肌纖維化相關(guān)蛋白表達的影響。
A：心肌纖維化及 TGF-β1 信號通路相關(guān)蛋白表達水平；
B：心肌纖維化相關(guān)蛋白表達的定量分析。所有蛋白表達均以 GAPDH 進行歸一化；
C：TGF-β1 信號通路相關(guān)蛋白的定量分析。所有蛋白表達均以 GAPDH 進行歸一化；
D：Sal B 對高糖誘導(dǎo) CFs 中 Smad7 表達的影響；
E：Smad7 表達定量分析。
細胞實驗重復(fù) 3 次。數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組比較采用單因素方差分析，并進行 Tukey 檢驗。<0.05，#<0.01 vs. 對照組；*p<0.05，**p<0.01 vs. DCM 組。

7. Sal B 通過去泛素化 Smad7 并穩(wěn)定 Smad7 蛋白表達改善心肌纖維化

研究者假設(shè) Sal B 可能通過基因轉(zhuǎn)錄增加 Smad7 表達，因此采用 qRT-PCR 探討 Sal B 對高糖誘導(dǎo) CFs 中 Smad7 mRNA 表達的影響。與對照組相比，高糖組 Smad7 mRNA 表達水平略有降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Sal B 處理后，Smad7 mRNA 水平略有升高，但差異同樣無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明，Sal B 并未增加 Smad7 的 mRNA 表達。

因此，研究者推測 Sal B 可能抑制 Smad7 的降解。為確定 Sal B 對 Smad7 蛋白穩(wěn)定性的影響，使用蛋白合成抑制劑環(huán)己酰亞胺（CHX）抑制新蛋白合成。在 CHX 處理后 1、2、4、8 和 12 h 檢測 Smad7 蛋白表達。HG 組 Smad7 表達逐漸降低；Sal B 組 Smad7 表達在 1 h 時最高，并維持在較高水平。在 2、4、8 和 12 h 時，Smad7 表達存在顯著差異，說明 Sal B 可顯著穩(wěn)定 CFs 中 Smad7 的表達。

既往研究表明，心肌纖維化可促進 Smad7 泛素化并降低其穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致 Smad7 表達下降。本研究進一步驗證 Sal B 是否可通過阻止 Smad7 泛素化改善 DCM 中的心肌纖維化。免疫沉淀實驗顯示，與對照組相比，Sal B 顯著降低 Smad7 泛素化水平。這些結(jié)果證實，Sal B 可通過抑制 Smad7 泛素化發(fā)揮抗纖維化作用。

圖7 圖注翻譯：Sal B 對 Smad7 表達的作用機制。
A：Smad7 和 GAPDH 的擴增曲線；
B：Smad7 和 GAPDH 的熔解曲線；
C：Sal B 誘導(dǎo) Smad7 mRNA 表達的定量分析。Smad7 mRNA 表達水平以 GAPDH 歸一化，采用 2^-△△Ct 方法計算；
D：高糖誘導(dǎo)不同時間點 Smad7 表達水平；
E：Sal B 誘導(dǎo)不同時間點 Smad7 表達水平；
F：Smad7 蛋白表達定量結(jié)果。Smad7 蛋白水平以 GAPDH 歸一化；
G：Sal B 對 Smad7 泛素化的影響。
細胞實驗重復(fù) 3 次。數(shù)據(jù)以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組比較采用單因素方差分析，并進行 Tukey 檢驗。<0.05，#<0.01 vs. 對照組；*p<0.05，**p<0.01 vs. DCM 組。

圖8 圖注翻譯：Sal B 改善 DCM 中心肌纖維化的機制。
圖8 示意 Sal B 通過影響 Smad7 泛素化、穩(wěn)定 Smad7 蛋白表達，并抑制 TGF-β1/Smad 信號通路活化，從而減輕高糖環(huán)境下的心肌纖維化過程。

【Citation】:Luo H, Fu L, Wang X, Yini Xu, Ling Tao, Shen X. Salvianolic acid B ameliorates myocardial fibrosis in diabetic cardiomyopathy by deubiquitinating Smad7.Chin Med.2023;18(1):161. Published 2023 Dec 10.

【貢獻】★★★★★

總之，本研究證明，在 DCM 小鼠模型中，Sal B 可通過經(jīng)典 TGF-β/Smad 通路抑制膠原形成和沉積，從而部分改善心肌纖維化。此外，連續(xù) 8 周 Sal B 治療改善了糖尿病小鼠左心室的結(jié)構(gòu)和功能。

因此，Sal B 是一種有前景的治療 DCM 誘導(dǎo)心肌纖維化的潛在藥物。然而，仍需要更多臨床數(shù)據(jù)來證實 Sal B 治療 DCM 患者的安全性和有效性，并需要進一步研究以闡明其潛在作用機制。

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