清華大學(xué)《自然·通訊》：PVA防曬霜！

紫外線（UV）對眼睛的傷害是一個長期被忽視的健康問題。根據(jù)論文引言中的數(shù)據(jù)，約95%的人知曉紫外線會損傷皮膚，但僅有7%的人認識到紫外線可導(dǎo)致眼部疾病。累積性紫外線暴露已被證實是翼狀胬肉、皮質(zhì)性白內(nèi)障和光角膜炎等多種眼部疾病的病因。在陽光中的紫外線到達人眼時，超過95%的紫外線能量被角膜、虹膜和晶狀體吸收。成年人中僅1%-2%的紫外線能到達視網(wǎng)膜，而在瞳孔更大、晶狀體更透明的兒童（8-10歲）中，這一比例上升至2%-5%。這意味著兒童比成人更容易因紫外線暴露而出現(xiàn)眼部問題。目前，佩戴太陽鏡是最常見的眼部防曬方式，但太陽鏡僅能阻擋約45%的環(huán)境紫外線，周邊、反射和散射的紫外線仍能到達眼睛，甚至鏡片背向反射的紫外線還會增加眼睛的紫外線負擔。近年來開發(fā)的含小分子紫外線吸收劑的隱形眼鏡雖能附著于眼表，但小分子可能在使用過程中泄漏，且為保證透明度必須限制其用量，導(dǎo)致紫外線阻擋效果不足。而皮膚用防曬霜中的納米顆粒會阻擋視線，有機紫外線吸收劑增溶所需的乙醇、甘油等添加劑又會刺激或損傷眼睛。因此，開發(fā)一種安全、透明、水溶性且不損害視覺功能的眼部專用防曬劑，是一項迫切且具有挑戰(zhàn)性的需求。

針對這一挑戰(zhàn)，清華大學(xué)陶磊副研究員、北京大學(xué)口腔醫(yī)院毋育偉副主任醫(yī)師和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所Wang Bo合作，開發(fā)出一種基于聚乙烯醇（PVA）修飾的聚合物眼部防曬劑。研究團隊通過Hantzsch反應(yīng)將天然提取物丁香醛（SA）引入PVA結(jié)構(gòu)中，得到了PVA-SA衍生物。該聚合物在1wt%水溶液中具有高達80的防曬系數(shù)（SPF）、超過99%的紫外線阻隔率和84%的高透明度。在對雌性小鼠眼睛的急性刺激和長期安全性測試中，PVA-SA表現(xiàn)出極低的刺激性和良好的長期安全性。斑馬魚實驗表明，經(jīng)該聚合物保護的魚在紫外線暴露后仍能保持健康的眼組織和視覺引導(dǎo)行為。小鼠實驗進一步證實，該聚合物能有效保護視網(wǎng)膜免受紫外線誘導(dǎo)的損傷。相關(guān)論文以“A transparent PVA-based polymer sunscreen protects retinal tissue from ultraviolet damage”為題，發(fā)表在Nature Communications上。

圖1：紫外線對眼睛的損傷及眼睛的紫外線防護。 a, 紫外線誘導(dǎo)的眼部疾病以及紫外線到達兒童（8-10歲）和成人（≥25歲）視網(wǎng)膜的情況。 b, 當前的紫外線防護技術(shù)——佩戴太陽鏡和使用傳統(tǒng)紫外線阻斷劑。 c, 用于保護眼睛免受紫外線損傷的PVA基防曬劑示意圖。

研究團隊首先制備了三種PVA衍生物，分別引入苯甲醛（BA）、4-羥基苯甲醛（HBA）和丁香醛（SA）（圖2a）。通過核磁共振氫譜分析，在PVA衍生物的譜圖中觀察到了1,4-二氫吡啶結(jié)構(gòu)中-NH-基團的特征峰（8.7-8.9 ppm），而PVA原料中則沒有這些特征峰（圖2b）。傅里葉變換紅外光譜分析進一步證實，PVA衍生物在1530-1480 cm?1區(qū)域出現(xiàn)了苯環(huán)的特征吸收峰（圖2c）。這些結(jié)果共同證實了Hantzsch反應(yīng)的成功進行。紫外-可見透射光譜測試顯示，當PVA-SA濃度達到5 mg/mL（0.5 wt%）時，其水溶液幾乎能夠屏蔽整個紫外光譜區(qū)域（UVB: 280-320 nm; UVA: 320-400 nm），而PVA-BA和PVA-HBA溶液仍有部分紫外線透過（圖2d）。此外，在活性氮和活性氧清除能力測試中，PVA-SA表現(xiàn)出最高的清除率（圖2e）。基于優(yōu)異的紫外線阻隔能力和抗氧化性能，研究團隊選擇PVA-SA進行后續(xù)實驗。為了探究紫外線屏蔽機制，研究團隊合成了與PVA-SA中1,4-DHP側(cè)鏈結(jié)構(gòu)相似的模型分子M-SA，并通過密度泛函理論計算了其最高占據(jù)分子軌道和最低未占據(jù)分子軌道。計算結(jié)果表明，M-SA的帶隙為3.81 eV，對應(yīng)325 nm的波長，與實驗測得的吸收峰（364 nm）在合理偏差范圍內(nèi)，說明M-SA可通過電子從HOMO向LUMO躍遷來吸收紫外線（圖2f）。

圖2：PVA衍生物的制備與表征。 a, PVA衍生物的合成示意圖。 b, PVA及PVA衍生物的1H NMR譜圖（DMSO-d6, 400 MHz）。 c, PVA及PVA衍生物的FT-IR譜圖。 d, PVA衍生物水溶液（5 mg/mL）的紫外-可見透射光譜及280-370 nm放大光譜。 e, PVA衍生物對RNS和ROS的清除率。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示（n=3個獨立樣本）。 f, 使用密度泛函理論計算的M-SA的理論能帶隙。

在細胞層面，研究團隊使用人角膜上皮細胞系評估了PVA-SA的細胞毒性。CCK-8實驗結(jié)果顯示，在1-10 mg/mL濃度范圍內(nèi)與PVA或PVA-SA共培養(yǎng)24小時后，HCE-T細胞的存活率均超過90%，表明聚合物具有低細胞毒性。集落形成實驗進一步證實，單次或多次給藥后，PVA-SA組的集落形成情況與空白組相似，顯示出低長期細胞毒性。PVA-SA的SPF值經(jīng)測定為80，與市售皮膚用防曬霜（SPF 50+）相當，且10 mg/mL的溶液幾乎無色透明（400-800 nm透射率84%）。在紫外線防護實驗中，HCE-T細胞與PVA-SA共培養(yǎng)后接受UVA照射，F(xiàn)DA/PI雙染和CCK-8檢測結(jié)果顯示，PVA-SA組的活細胞數(shù)量與空白組相近，而單純UVA照射組和PVA處理組的活細胞數(shù)量顯著減少（圖3a）。全轉(zhuǎn)錄組RNA測序分析進一步揭示了PVA-SA的細胞保護機制。火山圖顯示，與UVA組相比，UVA+PVA-SA組共有683個基因上調(diào)、759個基因下調(diào)（圖3b）。基因本體論分析顯示，差異表達基因主要富集在與DNA/RNA轉(zhuǎn)錄和合成相關(guān)的條目中，如“RNA聚合酶II對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控”和“序列特異性雙鏈DNA結(jié)合”，這些條目還與細胞周期、細胞生長和增殖密切相關(guān)（圖3c）。京都基因與基因組百科全書通路富集分析表明，差異表達基因顯著富集在細胞生長、黏附和增殖相關(guān)通路（如PI3K-Akt信號通路、ECM-受體相互作用、MAPK信號通路和黏著斑）以及炎癥相關(guān)通路（如Notch信號通路和IL-17信號通路）（圖3d）。熱圖分析顯示，PVA-SA上調(diào)了與衰老抑制（如COL6A3、ITGA2）和血管生成抑制（如THBS1）相關(guān)的基因，同時下調(diào)了與細胞周期抑制（如CDKN1A、GADD45A）、炎癥（如CXCL2、CXCL8、IL1B）和血管生成（如VEGFA、ADM2）相關(guān)的基因（圖3e）。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析展示了與差異表達基因相關(guān)的相互作用網(wǎng)絡(luò)，揭示了上述生物學(xué)功能之間的密切關(guān)聯(lián)（圖3f）。基因集富集分析表明，PVA-SA組與RNA降解、IL-17信號通路和細胞衰老呈負相關(guān)（圖3g-i）。γ-H2AX染色實驗顯示，在紫外線照射前加入PVA-SA的“預(yù)防組”幾乎檢測不到綠色熒光信號，而照射后加入的“補救組”則可檢測到明顯熒光，表明PVA-SA通過直接阻擋UVA光來保護細胞，而非通過進入細胞緩解氧化應(yīng)激。

圖3：紫外線暴露后PVA-SA保護下HCE-T細胞的RNA序列分析。 a, 評估PVA-SA細胞紫外線保護效果的實驗流程示意圖。 b, 火山圖顯示UVA+PVA-SA組與UVA組相比的差異表達基因；p<0.05，|log2FC|>1。差異表達分析使用DESeq2（雙側(cè)）進行，未對多重比較進行調(diào)整。 c, 與DNA/RNA轉(zhuǎn)錄和合成相關(guān)的差異表達基因的基因本體論分析。弦圖表示轉(zhuǎn)錄組功能與基因之間的關(guān)系。左側(cè)顯示基因，旁邊的熱圖顯示基因的log FC值；右側(cè)顯示功能。弦將基因連接到其相應(yīng)的富集功能。 d, 差異表達基因的京都基因與基因組百科全書通路分析結(jié)果。差異表達分析使用DESeq2（雙側(cè)）進行，未對多重比較進行調(diào)整。 e, UVA組和UVA+PVA-SA組中差異表達基因表達的熱圖。紅色：上調(diào)；藍色：下調(diào)。對照組：UVA組。 f, 與DNA/RNA合成、細胞周期、炎癥、血管生成和衰老功能相關(guān)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用分析；數(shù)據(jù)庫：version-11-5.stringdb.org/organism/9606。 g-i, 基因集富集分析顯示，與UVA組相比，UVA+PVA-SA組中RNA降解通路、IL-17信號通路和細胞衰老通路中的差異表達基因下調(diào)。

研究團隊利用斑馬魚幼蟲模型評估了PVA-SA的體內(nèi)眼保護效果。斑馬魚幼蟲視網(wǎng)膜神經(jīng)發(fā)生在72小時受精后基本完成，其視覺引導(dǎo)行為（如驚跳反應(yīng)和趨光性）可用于評估視覺功能。將72 hpf的斑馬魚幼蟲分別置于PVA-SA和PVA溶液中培養(yǎng)，隨后接受UVA照射（圖4a）。驚跳反應(yīng)測試中，經(jīng)過10分鐘暗適應(yīng)后，幼蟲經(jīng)歷三個光-暗交替周期。圖4b展示了各組幼蟲在一個光-暗周期中的典型運動軌跡，空白組幼蟲在黑暗期的運動軌跡明顯比光照期更為廣泛。不同組幼蟲在交替光-暗周期中的游泳距離定量數(shù)據(jù)顯示，空白組在光照期和黑暗期的游泳距離存在明顯差異，而UV照射組的差異則顯著減小（圖4c）。具體而言，與空白組相比，UV組的光暗游泳距離差異顯著減小，UV+PVA組略有改善但依然較差，而UV+PVA-SA組的光暗游泳距離差異與空白組非常接近（圖4d）。這表明UV照射損害了幼蟲對明暗變化的敏感性，而PVA-SA能有效保護幼蟲免受UV損傷。趨光性測試中，將幼蟲限制在黑暗區(qū)后移除擋板，記錄游向光區(qū)的幼蟲數(shù)量（圖4e）。通過直接觀察，UV組和UV+PVA組的幼蟲從暗區(qū)游向光區(qū)的意愿明顯低于空白組和UV+PVA-SA組（圖4f）。定量數(shù)據(jù)顯示，UV組和UV+PVA組30只幼蟲中分別僅有4只和5只從暗區(qū)游向光區(qū)，而空白組和UV+PVA-SA組則分別為13只和10只（圖4g）。這進一步證實PVA-SA能有效保護幼蟲的視覺功能。

圖4：紫外線照射后斑馬魚幼蟲的行為分析。 a, 斑馬魚幼蟲驚跳反應(yīng)實驗流程示意圖。 b, 不同組幼蟲在一個光-暗周期中的典型運動軌跡。 c, 交替光-暗周期（2分鐘光照后2分鐘黑暗）對96 hpf斑馬魚幼蟲游泳距離的影響。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示（n=24條獨立斑馬魚）。結(jié)果共涉及96條幼蟲。 d, 不同組幼蟲在光照和黑暗區(qū)域游泳距離的差異。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示（n=24條獨立斑馬魚）。該實驗獨立重復(fù)三次，結(jié)果相似。統(tǒng)計結(jié)果使用獨立樣本Student t檢驗（單側(cè)）進行分析，未對多重比較進行調(diào)整。 e, 斑馬魚幼蟲趨光性測試實驗流程示意圖。 f, 各組幼蟲在光區(qū)數(shù)量達到最高時的趨光性測試截圖（n=30條獨立斑馬魚）。 g, 趨光性測試統(tǒng)計數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示（n=30條獨立斑馬魚）。該實驗獨立重復(fù)三次，結(jié)果相似。

研究團隊還通過組織學(xué)分析評估了PVA-SA對斑馬魚幼蟲眼組織的保護效果。吖啶橙染色顯示，UV組和UV+PVA組幼蟲眼部出現(xiàn)明亮的綠色熒光斑點，指示凋亡細胞中的染色質(zhì)凝聚，而空白組和UV+PVA-SA組幾乎檢測不到熒光信號（圖5a）。H&E染色組織學(xué)圖像顯示，UV組和UV+PVA組幼蟲眼部周圍出現(xiàn)炎性細胞浸潤，神經(jīng)節(jié)細胞層出現(xiàn)明顯的空隙，表明可能存在細胞核丟失和結(jié)構(gòu)紊亂（圖5b）。定量分析表明，與健康幼蟲相比，UV組和PVA處理組的神經(jīng)節(jié)細胞層細胞核數(shù)量顯著減少，而UV+PVA-SA組則與空白組相近（圖5c）。不同組幼蟲眼各細胞層厚度的測量結(jié)果顯示，UV組和UV+PVA組的神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層和光感受器層厚度均顯著減少，而UV+PVA-SA組的各細胞層厚度與空白組非常接近（圖5d）。TUNEL染色在所有組中均未檢測到明顯的紫外線誘導(dǎo)的DNA斷裂。這些結(jié)果證實PVA-SA能有效保護斑馬魚幼蟲的眼部結(jié)構(gòu)免受紫外線損傷。

圖5：PVA-SA對斑馬魚眼睛的紫外線保護。 a, 不同組幼蟲眼睛的吖啶橙染色圖像。白色箭頭指示凋亡細胞。比例尺：50 μm。該實驗獨立重復(fù)三次，結(jié)果相似。 b, 不同組幼蟲眼睛的蘇木精和伊紅染色圖像。箭頭指示神經(jīng)節(jié)細胞層中的空隙，圓圈指示UV組和PVA組中的炎性細胞浸潤。比例尺：50 μm。 c, 不同組神經(jīng)節(jié)細胞層中的細胞核數(shù)量。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示（n=3條獨立斑馬魚）。統(tǒng)計結(jié)果使用獨立樣本Student t檢驗（單側(cè)）進行分析，未對多重比較進行調(diào)整。 d, 不同組中神經(jīng)節(jié)細胞層、內(nèi)叢狀層、光感受器層、視網(wǎng)膜色素上皮層和內(nèi)核層的厚度。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示（n=3條獨立斑馬魚）。每個樣本的厚度在樣本的不同位置測量五次。

在安全性評估方面，研究團隊對BALB/C小鼠進行了急性眼刺激試驗（圖6a）。將小鼠分為四組，分別給予生理鹽水、十二烷基硫酸鈉、PVA和PVA-SA。裂隙燈顯微鏡觀察顯示，SDS處理0.5小時后小鼠出現(xiàn)眼瞼腫脹、角膜混濁、角膜缺損和潰瘍，而生理鹽水、PVA和PVA-SA處理組幾乎沒有異常；24小時后，SDS組的角膜損傷依然明顯，而PVA和PVA-SA組仍保持健康（圖6b）。H&E染色顯示，SDS組角膜上皮細胞明顯剝脫和破裂，而PVA和PVA-SA組角膜上皮細胞排列致密、有序且完整（圖6c）。TUNEL染色顯示SDS對角膜組織損傷嚴重，出現(xiàn)明亮熒光，而PVA-SA組幾乎檢測不到損傷（圖6d）。在眼內(nèi)滯留能力測試中，PVA-SA在小鼠眼內(nèi)的殘留量在30分鐘內(nèi)降至30.3%，60分鐘和90分鐘時分別降至13.0%和1.9%，半衰期約為15分鐘（圖6e）。研究團隊進一步驗證了PVA-SA對小鼠視網(wǎng)膜的紫外線保護效果。H&E染色結(jié)果顯示，與空白組相比，UV組視網(wǎng)膜細胞層厚度顯著減少，外核層變得紊亂且出現(xiàn)明顯核丟失，而UV+PVA-SA組的視網(wǎng)膜細胞層與空白組非常相似，細胞層排列有序，形態(tài)正常（圖6f）。定量分析顯示，UV組外核層細胞核數(shù)量較空白組顯著減少，而UV+PVA-SA組的外核層細胞核數(shù)量與空白組無顯著差異（圖6g）。在體內(nèi)安全性評估中，研究團隊通過靜脈注射對小鼠給予高劑量PVA-SA（圖6h）。血液檢測顯示，與健康小鼠相比，PVA-SA注射組的尿素、肌酐、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和白蛋白水平均無顯著變化（圖6i-l）。在14天長期毒性試驗中，PVA-SA處理組小鼠的眼瞼和角膜未見異常，主要器官組織學(xué)分析和血清生物標志物水平均未見明顯異常。

圖6：PVA-SA的體內(nèi)安全性及其對小鼠視網(wǎng)膜的紫外線保護。 a, 急性眼刺激試驗實驗流程示意圖。 b, 不同處理后0.5小時和24小時小鼠眼睛熒光素角膜染色的代表性裂隙燈圖像。比例尺：1 mm。該實驗獨立重復(fù)三次，結(jié)果相似。 c, 不同處理72小時后小鼠眼睛的H&E染色。比例尺：1 mm。下圖顯示角膜的放大圖像。箭頭指示SDS組角膜的破裂細胞。比例尺：100 μm。該實驗獨立重復(fù)三次，結(jié)果相似。 d, 不同處理72小時后小鼠角膜組織的TUNEL染色。藍色：DAPI，綠色：TUNEL。比例尺：200 μm。該實驗獨立重復(fù)三次，結(jié)果相似。 e, PVA-SA在小鼠眼中的滯留時間。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示（n=3個獨立眼球）。 f, 不同處理后小鼠視網(wǎng)膜的H&E染色圖像。比例尺：50 μm。 g, 不同組外核層中的細胞核數(shù)量。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示（n=5個獨立眼球）。統(tǒng)計結(jié)果使用獨立樣本Student t檢驗（單側(cè)）進行分析，未對多重比較進行調(diào)整。 h, 靜脈注射PVA-SA的方案示意圖。 i-l, 健康小鼠以及靜脈注射PVA（30 mg）和PVA-SA（30 mg）72小時后小鼠的不同血清生物標志物水平：i 尿素；j 肌酐；k 天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；l 白蛋白。p值通過將數(shù)據(jù)與健康組數(shù)據(jù)比較獲得。數(shù)據(jù)以平均值±SD表示（n=6只獨立小鼠）。統(tǒng)計結(jié)果使用獨立樣本Student t檢驗（單側(cè)）進行分析，未對多重比較進行調(diào)整。

綜上所述，本研究成功開發(fā)了一種可直接用于眼睛的聚合物防曬劑，能夠在不同方向上阻擋紫外線而不損害視覺功能。研究團隊通過Hantzsch反應(yīng)將天然來源的丁香醛引入人工淚液活性成分PVA中，獲得了具有高SPF值（80）、高透明度（84%）和優(yōu)異紫外線阻隔率（>99%）的PVA-SA。該聚合物在短期和長期使用中均表現(xiàn)出低細胞毒性，能有效保護角膜上皮細胞和原代人真皮成纖維細胞免受紫外線誘導(dǎo)的DNA/RNA損傷、炎癥、血管生成和衰老。在體內(nèi)實驗中，PVA-SA能有效保護斑馬魚幼蟲免受紫外線損傷，使其在紫外線照射后仍能保持幾乎完整的視覺引導(dǎo)行為和健康的眼組織。此外，PVA-SA在小鼠眼中表現(xiàn)出極低的急性眼刺激性和良好的長期生物安全性，并能有效保護小鼠視網(wǎng)膜免受紫外線誘導(dǎo)的損傷。這項目標導(dǎo)向的研究成功利用天然產(chǎn)物和多組分反應(yīng)開發(fā)了一種兼具優(yōu)異安全性和抗紫外線性能的眼部防曬劑，為開發(fā)高附加值生物材料提供了有效策略。未來研究可進一步探索利用PVA-SA優(yōu)異的抗氧化能力治療干眼綜合征等與氧化應(yīng)激相關(guān)的眼部疾病。此外，使用高分子量PVA開發(fā)抗紫外線聚合物，有望在低濃度、低粘度條件下實現(xiàn)更長的眼表滯留時間，推動實際應(yīng)用。